A combinação de 8-MOP e radiação UVA (320-400 nm) conhecida como terapia PUVA é usada no tratamento de psoriase e vitiligo. O exato mecanismo molecular responsável pela eficácia da terapia PUVA, ainda é um assunto em debate. Neste estudo, investigamos a fototoxicidade e a indução de apoptose. em cultura de células de melanoma humano. Células da linhagem SKMEL 37 foram tratadas com diferentes concentrações de 8-MOP, irradiadas com luz UVA (0,3J/cm²) seguindo-se de incubação por 24, 48 e 72 horas. A citotoxicidade de 8-MOP foi analisada pela medida da atividade de desidrogenase mitocondrial (método do MTT). O DNA foi extraído e observado em gel de agarose após eletroforese. Verificou-se a fragmentação do DNA no tratamento com 45 m M de 8-MOP e incubação por 24 horas. A ativação da caspase 8 foi avaliada usando o ensaio colorimétrico ApoAlert (Contech) e os resultados demonstraram a ativação desta enzima. Foi observado a perda das propriedades de adesão e um arredondamento celular após o tratamento com 8-MOP/UVA. Um conhecimento mais aprofundado do mecanismo de ação desse psoraleno nos permitirá entender melhor a sua eficácia terapêutica.

O aumento vertiginoso do melanoma têm sido motivo de muita preocupação para os profissionais da saúde pelo seu difícil prognóstico e pela formação de metástase. Segundo informações do Instituto Nacional do Câncer (Inca), 35% das pessoas que desenvolvem melanoma no Brasil vão a óbito (BORGES, 2003). O desenvolvimento de terapias que sejam seletivas para tecidos de tumor é uma das maiores metas na pesquisa anti-câncer. Visto a crescente incidência de tumores disseminados na prática médica, torna-se relevante a necessidade de encontrar, desenvolver e introduzir no "armamentário" médico modalidades terapêuticas mais eficientes (Yones et al, 2000). O tratamento clínico com a furanocumarina 8-metoxipsoraleno pode representar uma nova alternativa terapêutica para o melanoma. Estes são largamente empregados no tratamento de afecções cutâneas tais como psoríasis e vitiligo (GASPARRO, 2000). O tratamento PUVA (psoralenos em combinação com luz ultravioleta A) tem ação direta no DNA, mas seu mecanismo de ação pelo qual a droga exerce sua ação citotóxica ainda permanecem desconhecidos. Tendo em vista o potencial deste tratamento, visamos investigar mecanismo de ação do 8-metoxipsoraleno em células de melanoma humano.

Após o plaqueamento das células, foi verificado o potencial citotóxico de 8-MOP pelo método de MTT. Foram utilizadas diferentes alíquotas a partir de uma solução de 4600 m M de 8-MOP, incubadas por 1 hora e irradiadas com lâmpada de UVA sob fluência de 0,32 mJ/cm²/s. As células foram coletadas e seguindo-se da adição do tampão de lise (SDS 0,5%) e incubação por 2 horas com Rnase e proteinase K a 37ºC. As amostras foram submetidas a eletroforese segundo a metodologia proposta por Walker et al, 1999. Para a dosagem de caspase 8, as amostras foram lisadas com "Cell Lysis Buffer" fornecido pelo kit e incubadas substrato IETD-pNA (ApoAlert (Clontech) por 2 horas a 37ºC . A leitura da absorbância (que é proporcional ao teor de caspase da amostra) foi feita no leitor ELISA e o valor foi normalizado pela quantidade de proteína total da amostra.

Estudos recentemente publicados por nossa equipe demonstraram o efeito fototóxico do tratamento PUVA sobre células de melanoma humano em cultura (LEITE, et al. 2004). Entretanto o mecanismo de ação de 8-MOP ainda não é conhecido. Nossos resultados parecem indicar um mecanismo envolvendo a apoptose celular. Os resultados verificados em gel de eletroforese são apresentados na Figura 3.-Figura 1. Verificou-se um arraste-fragmentação do DNA na amostra tratada com 45 m M de 8-MOP com UVA nos intervalos de tempo de 24, 48 e 72 hs (canaletas: 6A , 6B e 6C). No entanto, esse arraste-essa fragmentação é mais evidente no tratamento com o período de 24 hs (canaleta 6A). O tratamento às células com as doses mais elevadas (concentrações acima de 50 m M) e intervalos de tempos maiores (48-72 hs) deve induzir necrose celular devido ao elevado efeito fototóxico.

Figura 4-Figura 2: A) Atividade relativa de caspase 8, para células de melanoma tratadas com diferentes concentrações de 8-metóxipsoraleno e irradiação UVA (0.3J/cm2). Os valores foram na terapia PUVA- normalizados pela quantidade de proteina das amostras em cultura de células de melanoma humano-. B) Curva padrão para dosagem de proteinas, empregando-se de proteína soro albumina bovina. A ordenada representa a absorbância (nm-) enquanto que a abscissa representa a concentração (m g/m L).

A análise de DNA das amostras tratadas com 8-MOP indicam sua fragmentação, embora não seja evidente o aparecimento do perfil característico das bandas relativas ao nucleossomos formados nos eventos apoptóticos, O tratamento PUVA induziu as células à apoptose por indução da caspase-8, enzima envolvida em eventos apoptóticos.

Os resultados aqui apresentados podem contribuir para a elucidação do mecanismo de ação de psoralenos bem como na –para a indicação da PUVA terapia no tratamento de melanoma humano.

BORGES,J. Melanoma, a forma mais letal da doença. Scientific American- Brasil, ano 2, nº 15, p.49-50, 2003.

GASPARRO, F.T. The role of PUVA in the treatment of psoriasis. Photobiology issues related to skin cancer incidence. American Journal of Clinical Dermatology, v. 6, 337-348, 2000.

LEITE, V.C., SANTOS, R.F., CHEN, L.C., GUILLO, L.A. Psoralen derivatives and

longwave ultraviolet irradiation are active in vitro against human melanoma cell line.

Journal of Photochemistry and Photobiology B, v. 76, 49-53, 2004.

YOUNES, R. N., VARELLA, AD., SUFFREDINI, I.B. Seleção, extração e identificação de drogas novas anticâncer de plantas brasileiras. Acta Oncológica Brasileira, v.21, p.1-6, 2001.

WALKER, P. R., LEBRANC, J., SMITH, B., PANDEY, S. SIKORSKA, M. Detection of DNA fragmentation and endonucleases in apoptosis. METHODS: A companin-A companion to Methods in Enzimology v.17 p. 329-338,1999.

Fonte de Financiamento: CAPES, UFG, CNPQ