A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose humana, sistêmica transmitida pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. A parede celular de fungos é uma estrutura essencial, envolvida em vários processos fisiológicos e é uma estrutura antigênica. Glucana, uma das macromoléculas que constituem a parede celular de fungos, sendo o principal componente estrutural que fortalece a parede. Nosso grupo tem trabalhado no isolamento, caracterização e expressão de genes que codificam para enzimas envolvidas na síntese e degradação de componentes da parede celular de P. brasiliensis para a utilização das como alvos para drogas antifúngicas. O objetivo deste trabalho é a continuação de resultados mostrados anteriormente (PIVIC-2002/2003 e PIBIC-2003) onde foi feita clonagem da região catalítica (PbFkspc) no vetor de expressão pGEX 4T-3 e expressão heteróloga da proteína recombinante. Conseguimos solubilizar a proteína recombinante com a utilização do detergente sarcosil. Em seguida partimos para a purificação da proteína recombinante com a utilização da resina de glutationa 4B cuja GST (proteína presente no vetor de expressão pGEX 4T-3) tem afinidade para ligar-se. Após ligação à resina a proteína recombinante foi clivada da GST por trombina liberando assim a proteína heteróloga.

Palavras-chave: glucana sintase, P. brasiliensis, exoressão heteróloga

O fungo Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da micose humana denominada Paracoccidioidomicose (PCM) (Almeida, 1930). A inalação pelo hospedeiro humano de micélios e/ou propágulos do fungo é a principal via de entrada do parasita.

A parede celular de fungos é uma estrutura essencial, altamente dinâmica e está envolvida em vários processos fisiológicos, além de ser antigênica (Navaro-Garcia et al., 2001)

Glucana é o principal componente estrutural que fortalece a parede celular de fungos, entre eles, P. brasiliensis. Nós isolamos e caracterizamos o gene de b -1,3-glucana sintase de P. brasiliensis (PbFKS1) (Pereira et al., 2000). Drogas que inibem b -1,3-glucana sintase, têm apresentado sucesso no tratamento de infecções fúngicas (ANDES, 2003;). Nosso grupo tem trabalhado com enzimas envolvidas na síntese e degradação de componentes da parede celular de P. brasiliensis para a utilização das mesmas no desenvolvimento de drogas antifúngicas.

Nosso objetivo é a purificação da proteína recombinante PbFksc para produção de anticorpos e realização de experimentos de atividade enzimática.

Optamos por trabalhar com a região catalítica do gene isoladamente por dificuldades estruturais. A amplificação e clonagem desta foi mostrada em resultados anteriores (PIVIC-2002/2003 e PIBIC-2003)

O vetor de expressãp pGEX 4T-3 foi utilizado para a clonagem da região catalítica de PbFKS1, denominada PbFKSc. A clonagem foi realizada em células de E. coli BL-21, específicas para expressão heteróloga. O promotor do vetor foi induzido por IPTG. Em seguida foi realizada a solubilização da proteína. Este procedimento foi baseado no protocolo do fabricante mas com algumas modificações, como a adição de sarcosil ao sistema para melhorar a solubilização dos corpos de inclusão.

No intuito de purificar a proteína recombinante, foi utilizada uma coluna de sepharose glutationa. Este material tem alta afinidade pala GST (proteína do vetor expressa juntamente com a proteína de fusão) possibilitando a purificação da proteína de fusão que esta ligada a ela.

Após purificação da proteína de fusão esta passou por um tratamento com trombina, enzima capaz de clivar o sítio de ligação da proteína heteróloga com a GST. Desta forma, após a clivagem obtivemos a proteína heteróloga pura para realizarmos outros estudos.

Coseguimos com sucesso a clonagem, expressão heteróloga e purificação de PbFksc. Após clivagem da proteína de fusão conseguimos analisá-la em gel de poliacrilamida, mas não foi possível eluí-la. Desta forma utilizamos a banda do gel correspondente a esta proteína para infectar coelhos afim de produzir anticorpos policlonais anti-PbFksc. No momento estamos padronizando um protocolo de eluição da PbFkspc a partir de gel de poliacrilamida para, a realização de experimentos de atividade enzimática

1. Almeida, F. Estudos comparativos do granuloma coccidioico nos Estados Unidos e no Brasil. Novo gênero para o parasita brasileiro. An. Fac. Med. S. Paulo, v.5, p.125-141, 1930. 2. ANDES, D.; MARCHILLO, K.; LOWTHER, J.; BRYSKIER, A.; STAMSTAD, T.; CONKLIN, R. In vivo pharmacodynamics of HMR 3270, a glucan synthase inhibitor, in murine candidiase model. Antimic. Agents and Chemot., v.47, n.4, p.1187-1192, 2003. 4. NAVARRO-GARCIA, F.; SÁNCHEZ, M.; NOMBELA, C.; PLA, J. Virulence genes in the pathogenic yeast Candida albicans. Microbiol. Rev., n.25, p.245-268, 2001. 5. Pereira, M.; Felipe, M.S.S.; Brígido, M.M.; Soares, C.M.A.; Azevedo, M.O. Molecular cloning and characterization of a glucan synthase gene from the human pathogenic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Yeast, v.16, p.451-462, 2000.

Apoio financeiro: CNPq, FUNAPE-UFG