DINÂMICA E PARTIÇÃO DE MARCADORES LIPÍDICOS NO ESTRATO CÓRNEO

QUEIRÓS, W.P; NETO, D. S; ALONSO, A

       Instituto de física, Universidade Federal de Goiás, Goiânia 74001-970, GO, Brasil

            e-mail, wellington.queiros@bol.com.br, Alonso@fis.ufg.br

Palavras chaves: Estrato Córneo, Ressonância Paramagnética Eletrônica, Marcadores Lipídicos.

 

INTRODUÇÃO

A maior barreira para penetração de matéria  pela pele é fornecida pela camada superficial da pele, o estrato córneo (EC). Entre outras propriedades, o EC controla a perda transpidermal de água e a permeação de substâncias através da pele.   

 O EC é composto por células mortas,  os corneócitos, formadas em seu interior por proteínas chamadas queratinas, um envelope celular insolúvel de proteínas com ligações cruzadas, e um envelope lipídico celular composto principalmente de ω-hidroxiceramidas covalentemente ligados à periferia do envelope celular. Além disso, possui uma complexa mistura lipídica na região intercelular os quais  interligam com o envelope lipídico celular formando uma estrutura conhecida como lamelas lipídicas.

A composição dos lipídios é única. Ao contrário de outras membranas biológicas, o EC é quase destituído de fosfolipídios e os principais constituintes são as ceramidas 41%, colesterol 27%, ésteres de colesteril 10%, ácidos graxos livres 9%, e uma pequena fração de sulfato de colesterol 2%, o qual tem um importante papel no processo de descamação do EC [1,2,3].

As proteínas que compõem o interior do corneócitos são constituídas por cadeias polipeptídicas ricas em ligações cruzadas de dissulfeto (S-S), as quais reduz a absorção de drogas nas células. Por estas razões é que  as substâncias ativas aplicadas sobre a pele são difundidas ao longo das lamelas lipídicas na região intercelular [4]. Nos últimos 20 anos, têm sido focalizados muitos estudos sobre a composição e organização dos lipídios do estrato córneo e as mudanças envolvidas nestas organizações como uma conseqüência de aplicação tópica de drogas, no tratamento de doenças de pele, e para uma maior compreensão na função de barreira da pele.

 

MATERIAIS E MÉTODOS

 

·        AS membranas de EC são obtidas de ratos recém-nascidos com menos de 24h.

·        O EC foi tratado com ácido oléico aplicado diretamente sobre o EC marcado, em uma relação de (1:8, w/w) e incubado em tampão (50 ml) por 1h.

·        A simulação dos espectros de RPE foi feita com um programa desenvolvido por Freed e colaboradores, o “nonlinear least –squares” (NLLS).

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

 

Neste trabalho utilizamos a técnica de Ressonância Paramagnética eletrônica (RPE) de marcadores lipídicos derivados do ácido esteárico, com o grupo doxil (radical nitróxido) ligado nas posições 5, 12 ou 16 da cadeia metilênica (5-, 12- e 16-DSA), e também o estearato de metila marcado na posição 5 (5 DMSA), estruturados nos domínios lipídicos do EC, para investigar os efeitos de moléculas aumentadoras da permeação tais como o ácido oléico, sobre a dinâmica dos lipídios do EC. Após a análise  dos  espectros de (RPE) verificamos que ocorre à partição dos marcadores lipídicos com a formação  de duas componentes espectrais  caracterizadas por um equilíbrio termodinâmico; uma de menor mobilidade (componente 1) surge quando os marcadores de spin estão ligados na superfície polar das membranas e a de maior mobilidade (componente 2) é gerada pelos marcadores de spin  inserido numa região mais hidrofóbico.

Através da simulação foi possível estimar as populações relativas de spin de cada componente do espectro, mostrando que a razão das populações das duas componentes, N1/N2, na composição do espectro diminui com o aumento da temperatura (Fig.1) e, uma vez que este processo é completamente reversível, estas componentes estão claramente em equilíbrio termodinâmico. Então estas duas componentes devem surgir dos dois estados intercambiáveis dos marcadores de spin: (1) fazendo ligação de hidrogênio e (2) não fazendo ligação de hidrogênio com as superfícies polares das camadas lipídicas.

Se considerarmos que a relação das populações dos marcadores de spin é dada pela distribuição de Boltzmann, e que estas estão em equilíbrio termodinâmico podemos reescrever essa relação em termos dos potenciais termodinâmicos [5].

ln N1/N2 = ln K = - ∆G0/RT = ∆S0/R -  ∆H0/RT,                                                     (1)

onde K é a constate de equilíbrio, ∆S0 e ∆H0 são as mudanças de entropia e entalpia  no estado de equilíbrio. A equação (1) mostra que, na prática, os valores numéricos de ∆S0 e ∆H0 podem ser determinados a partir do gráfico de ln K X 1/T (fig.1).    

Caixa de texto: Fig.1 Razão entre as populações de spin das componetes 1 e 2 obtidas da simulação dos espectros de RPE em função do inverso da temperatura absoluta, para o EC marcado com os marcadores 5-DSA (círculos pretos), 12-DSA (quadrados verdes), 5-DMSA (losângulos azuis), EC tratado com ácido oléico marcado com 5-DSA (círculos rosados), e 16-DSA (triângulos vermelhos).

 Como a maioria dos nitróxidos podem formar ligação hidrogênio quando posicionados no 50 átomo de carbono da cadeia hidrocarbonada  o isômero 5 doxil foi o mais fortemente ligado às superfícies polares (∆G02→1 = -1,75 Kcal/mol e ∆H02→1 =13,8 Kcal/mol) e como o 5 metil doxil mais lipofílico, a população de spin estabilizada no meio hidrofóbico é maior (∆G02→1 = -0,57 Kcal/mol e ∆H02→1= -9,1 Kcal/mol). No EC deslipidizado com a mistura de clorofórmio/metanol, ocorre um aumento da interação do marcador com a superfície polar, decrescendo a difusão rotacional. Ao contrário, o tratamento do EC com ácido oléico aumenta drasticamente a mobilidade do marcador, particularmente aqueles da componente 1, e o equilíbrio termodinâmico é deslocado para a formação da componente 2.

 

 


CONCLUSÕES

·        Os resultados experimentais mostraram que os ácidos graxos sofreram divisão dentro dos domínios lipídicos do EC com uma classe de moléculas fazendo ligação de hidrogênio com a superfície polar e a outra sem este contato e com mais mobilidade, é estabilizada mais profundamente no meio hidrofóbico.

·        A posição do doxil no marcador de spin afeta a energia livre e entalpia observada.

·        O marcador mais lipofílico 5-DMSA fica mais inserido no core hidrofóbico.

·        No EC deslipidizado o marcador 16-DSA aumentou sua estabilidade na região polar da membrana com uma redução no valor de ∆G02→1 de +0,34 Kcal/mol para –0,51 Kcal/mol) implicando que a ausência de membranas intercelulares diminui a probabilidades dos marcadores de spin formarem a componente 2 de maior energia.

·        O tratamento do EC com o ácido oléico, um aumentador de permeação da pele, favorece a formação da componente 2, com um significante aumento na ∆G02→1 e uma redução na mudança de entalpia.

·        O ácido oléico causa um aumento drástico na fluidez lipídica, especialmente na região dos grupos polares.

 

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 

[1] SUHONEN, M. T; BOWSTRA, J. A; URTTI, A. (1999): Chemical enhancement of percutaneous absorption in relation to stratum corneum alterations. Journal controlled release. 149-161.

[2] SHURER, N.Y; ELIAS, P.M. (1991): The biochemistry and function of stratum corneum lipids. Progress in Lipid Research 24: 27-56.

[3] BOWSTRA, J. A; NGUYEN, P. L. H; GOORIS, S. G; PONEC, M. (2003): Structure of the skin barrier and its modulation by vesicular formulations. Progress in Lipid Research 42: 1-36.

[4] BOWSTRA, J. A; NGUYEN, P. L. H. (2002): Skin structure and mode of action vesicles. Advanced Drug Delivery Reviews. 54: 41-55.

[5] COUTO, S.G. RPE de proteínas marcadas nos resíduos de lisina: Efeitos da uréia em Estrato Córneo e Albumina. (2003) Dissertação  (Mestrado em Física) Instituto de física, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, 2003.

 

                                                                                       

 

                                                                        Fonte de financiamento:

                                                                                                 

                                                                             Capes, CNPq