PRODUÇÃO, PURIFICAÇÃO, CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E
APLICAÇÃO DAS XILANASES DE 23 E 25 KDA DO FUNGO Humicola grisea
CARVALHO, W.R.1; ULHOA, C.J.2;
ANDRADE, E.V.2; FARIA, F.P.2
1-Instituto
de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás; 2‑Instituto
de Ciências Biológicas II, Universidade Federal de Goiás
Endereço
eletrônico para contato: wagner_rc@yahoo.com.br; fabricia@icb.ufg.br
Palavras-Chave:
Xilanases; Expressão Heteróloga, Humicola grisea, Pichia pastoris
INTRODUÇÃO
A xilana é um polissacarídeo
heterogêneo, que requer para sua hidrólise, a ação de um complexo sistema
enzimático, composto por endo e exo-xilanases (Subramaniyan & Prema, 2002;
Sunna & Antranikian, 1997). As endoxilanases formam o maior grupo de
enzimas hidrolíticas envolvidas na degradação da xilana, hidrolisando as
ligações glicosídicas do tipo b‑1,4 dentro de sua cadeia (Biely et al.,1985). O grande interesse na produção
de xilanases está relacionado à vasta aplicação que está enzima possui no setor
industrial, como na indústria de bebidas, alimentícia e têxtil (Mutsaers et
al., 1991; Milagres & Prade,1994; Brice & Morrison, 1991). Na
indústria da celulose e papel, a xilanase livre de celulose pode ser utilizada
na etapa de biobranqueamento da polpa da celulose para a produção de papel. O
pré-tratamento com a xilanase facilita a extração da lignina o que reduz em até
34% a quantidade de cloro utilizado na etapa de branqueamento e no subseqüente
efluente industrial (Viikari et al.,1994; Viikari,1991).
As
enzimas xilanolíticas produzidas por fungos filamentosos constituem um
"pool" enzimático com atividades distintas, dificultando a sua
utilização direta nos processos industriais. Genes
codificando enzimas xilanolíticas têm sido clonados de fungos filamentosos e
expressos em sistemas heterólogos como bactérias, fungos filamentosos e
leveduras (Kurlkarni
et al.,1999).
O fungo termofílico Humicola
grisea var. thermoidea produz no
mínimo três distintas xilanases quando cultivado em diferentes substratos (Monti et al., 1991, Rana et al., 1995),
com massa molecular de 23, 25 e 35 kDa. Em trabalhos desenvolvidos pelo grupo
de pesquisa, a xilanase de 23 kDa foi purificada por gel filtração e apresenta
temperatura ótima de 65ºC, pH ótimo de 5,5, km e Vmáx
de 4,38mg.mL-1 e 3,32mmol.min-1.mL-1,
respectivamente. Em paralelo, um dos genes de endoxilanase do fungo H.
grisea denominado Hxyn2 foi isolado e expresso na levedura Pichia
pastoris sob o controle do promotor AOX1 (Faria, 2000).
O presente projeto de doutorado tem
como objetivo o estudo do sistema xilanolítico do fungo H. grisea com a
purificação e caracterização completa das xilanases de 23 e 25 kDa. Com vistas
a aplicação das enzimas xilanolíticas recombinantes em processos
biotecnológicos, será também purificada e caracterizada a enzima recombinante
HXYN2 a partir de P. pastoris. As enzimas purificadas e caracterizadas
serão então, aplicadas em teste piloto de biobranqueamento de polpa de
celulose.
MATERIAL
E MÉTODOS
A produção foi realizada
inoculando-se 0,35x106 esporos/mL em frascos erlenmeyers de
250 mL contendo 100 mL de Meio-Mínimo (Pontecorvo et al., 1953)
utilizando‑se como fonte de carbono 1% de bagaço de cana-de-açúcar lavado
e moído e, como fontes de nitrogênio, 0,05% de extrato de levedura e sulfato de
amônia (1:1), a 42ºC e 120 rpm por 96h.
Para a produção da enzima HXYN2r em P.
pastoris, inicialmente os transformantes foram selecionados por atividade
em placa e posteriormente analisados quanto produção da xilanase em frasco. A
cinética de produção foi realizada cultivando as células nos meios BMG (glicerol-1,0%;
fosfato de potássio‑pH 6,0, 100mM; extrato de levedura-1,34%) até OD600
de 3,0 e transferidas para o meio BMM (metanol-1,0%; fosfato de potássio-pH 6,0,
100mM; extrato de levedura‑1,34%) com a OD600 final de 1,0. As
células foram cultivadas em frascos de 125 mL, incubadas a 30oC e
250 rpm por 96h.
Conforme descrito por Miller (1959).
Conforme descrito por Laemmli (1970) e Teather & Wood (1982).
RESULTADOS
E DISCUSSÃO
Foi realizada a produção de
xilanases em H. grisea seguindo protocolo estabelecido por Carvalho
(2003), e obteve-se uma produção de 10 U/mL.
O
sobrenadante de cultura obtido foi filtrado a vácuo em resina de troca iônica Q‑Sepharose
com o objetivo de se retirar os pigmentos. O filtrado obtido será
posteriormente concentrado com sulfato de amônia, dialisado e aplicado em
colunas de gel filtração, para se obter a purificação das xilanases de 23 e 25
kDa, e sua subseqüente caracterização bioquímica.
Inicialmente os clones foram
testados quanto à atividade enzimática, em placas e, os clones selecionados
(12.3, 43.1, 43.4) foram utilizados na etapa de produção enzimática.
Para a produção da xilanase foram
testados os meios BMM Levedura, BMM‑Uréia e BMMY‑Uréia e, o que
forneceu o melhor resultado para atividade xilanolítica foi o meio BMM
Levedura. A máxima atividade xilanolítica obtida neste meio de cultivo foi de
27 U/mL.
Em ensaio de Zimograma do
sobrenadante de cultura foi observada a presença de uma banda com atividade
xilanolítica referente a uma proteína de massa molecular de 25 kDa em gel
SDS-PAGE.
CONCLUSÕES
O presente trabalho está em sua fase
inicial de desenvolvimento e os resultados obtidos até o momento nos permitiram
confirmar que a xilanase recombinante está sendo expressa na levedura P.
pastoris. As próximas etapas constarão da otimização da produção da
xilanase em P. pastoris, sua purificação, caracterização bioquímica e
testes de aplicação.
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
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Órgão
Financiador: CAPES