Produção e Caracterização das Fitases produzidas por
Trichoderma harzianum
LIMA,
R.C.M.; ULHOA, C. J.
Laboratório de Enzimologia – Instituto de Ciências Biológicas - Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular. e-mail: rhalcia@bol.com.br / ulhoa@icb.ufg.br
INTRODUÇÃO
Trichoderma sp é um Deuteromiceto, pertencente a sub-classe Hifomiceto,
ordem Monilialles (Hawksworth et al.,
1995, citado por BARA, 2002). Mais de 30 espécies deste gênero atualmente são
conhecidas. Algumas destas, são amplamente estudas por serem antagonistas de
nematóides e fungos fitopatógenos, sendo então utilizadas no controle biológico
(T. asperellum, T. harzianum, T.
longibrachiatum e T. atroviride).
São fungos filamentosos, heterotróficos e saprófitas, naturais do
solo, sendo encontrados em matéria orgânica em decomposição e na rizosfera de
diversas plantas. Caracterizam-se por utilizar uma grande variedade de
compostos como fonte de carbono e de nitrogênio. Ocorrem em todos os tipos de
solo embora se desenvolvam melhor em condições ambientais ácidos. São
mesófilos, sensíveis a altas temperaturas e pHs extremos, são resistentes a
inibidores produzidos por outros organismos e tolerantes a diferentes tipos de
fungicidas.
Trichoderma harzianum, uma das espécies mais importantes do gênero,
é descrito como um agente de controle biológico utilizado contra alguns
fitopatógenos, tais como Sclerotium
rolfsii, Rhizoctonia solani e Pythium sp (Herrera-Estrella & Chet,
1998). Um dos mecanismos de
antagonismo deste fungo é denominado micoparasitismo e se caracteriza pela
produção de enzimas hidrolíticas, como quitinases (EC. 3.2.1.14) e
N-acetilglucosaminidase (EC. 3.2.1.30), responsáveis pela quebra da parede
celular do fungo hospedeiro. Cepas com uma certa variação morfológica dentre os
isolados de T. harzianum foram
identificadas e caracterizadas em 1999 (Lima, 2002)., entre essas ALL – 42 e
ALL – 52. Através de estudos observou- se que estes isolados possuem uma alta
capacidade parasítica, bem como de
produção de enzimas hidrolíticas (Lima, 2002).
Fitases {EC.3.1.3.8 (mio-inositol–hexafosfato-3–fosfohidrolases)} são
classificadas dentro do grupo das fosfatases ácidas, as quais hidrolisam
eficientemente ácido fitíco em mio-inositol e ácido fosfórico (Mitchell et al., 1997, citado por Casey, 2003). A
presença de fitases tem sido detectado em uma variedade de organismos dentre
eles fungos e bactérias (Wodzinki and Ulah, 1996, citado por Casey, 2003). A
produção desta enzima é amplamente distribuída em alguns fungos, em particular
fungos de solo e água, tais como Aspergillus
e Rhizopus , Penicillium e Mucor(Liu
et al., 1998, citado por Vohra, 2003) e também alguns fungos termófilos como Thermomyces lanuginosus (Berka et al.,
1998, citado por Vorha, 2003) e Sporotrichum thermophile (Grosh, 1997,
citado por Vorha, 2003).
A fonte primária de ácido fitíco é estocado sob a forma de fósforo em sementes de plantas que são usadas como ingredientes de nutrição animal, como grãos de cereais, legumes e sementes oleosas. Em termos de nutrição animal, animais monogástricos tais como porcos e aves domésticas não são capazes de metabolizar fitato devido a falta de enzimas digestivas que hidrolisam o substrato. Com isso, fosfato inorgânico é adicionado em suas dietas para suprir o fósforo requerido. Como resultado esses grupos de animais excretam grandes quantidades de fosfato no meio ambiente, causando sérios problemas de poluição, contribuindo para eutrofilização das águas em áreas de intenso conjunto de produção. Contudo para seu próprio desenvolvimento, esses animais necessitam de fosfato em concentrações apropriadas.
A suplementacão da ração animal com
fitase aumenta a utilização de fosfato orgânico e diminuem os efeitos
anti-nutricionais de dietas ricas em fitato. Desta forma melhorando em última
instância a qualidade nutricional dessas dietas, minimizando a necessidade de
suplementação obrigatória com fosfato inorgânico, reduzindo a excreção de fosfato.
Suas aplicações biotecnológica estende–se a nutrição animal, como o reconhecimento da sua importância na alimentação industrial e aquacultura. Atualmente, existe um grande interesse em isolar novos organismos produtores destas enzimas, principalmente fungos filamentosos isolados de solo, um ambiente rico em fitato.
OBJETIVOS
Considerando o potencial de fungos do gênero Trichoderma em produzir enzimas de
interesse biotecnológico, é nosso objetivo neste trabalho de dissertação de
mestrado avaliar a produção de fitase por isolados de Trichoderma harzianum (ALL 52 e ALL 42), bem como purificar e
caracterizar a enzima produzida.
MATERIAIS E
MÉTODOS
Manutenção do fungo: Os
isolados Trichoderma harzianum ALL-42
e ALL-52 da Coleção do Laboratório de Enzimologia / UFG, serão mantidos com
repiques periódicos em meio MYG (0,5% de extrato de malte, 0,25% de extrato de
levedura, 1% de glicose e 2% de ágar) e estocado a 4°C.
Produção de Enzimas: Esporos
dos isolados , serão inoculados em frascos de 250 mL contendo 25 mL de meio de
TLE composto por: 1g/L de bactotriptona, 0,3g/L de uréia, 2,0g/L de KH2PO4,
1,4g/L de (NH4)2SO4, 0,3g/L de MgSO4.7H2O,
0,3g/L de CaCl2.6H2O e solução de elementos traços;
suplementado com 0,5% de substrato (farelo de milho) a ser testado como
indutor. Os frascos serão incubados em agitador rotatório à 28°C e velocidade
de 150 rpm. Após 6,12, 24, 48 e 72 horas de incubação o sobrenadante será
coletado e utilizado como fonte de enzimas.
Atividade Enzimática: A
atividade de fitase será determinada segundo metodologia descrita por Heinoen e
Lahti (1980), citado por Casey 2003, utilizando ácido fítico como substrato.
Determinação de Proteína: A
concentração de proteínas nas amostras será determinada pelo método descrito
por Bradford (1976), utilizando albumina bovina (Sigma-Co) como padrão.
Caracterização
eletroforética: Para análise do perfil de proteínas secretadas no meio de
cultura será utilizado um sistema de eletroforese (MiniGel-Sigma) em gel de
poliacrilamida 10% em condições desnaturantes, SDS-PAGE (Laemmli, 1970). Ao
final da corrida o gel será corado pelo método de coloração com nitrato de
prata segundo metodologia descrita por Blum et al., 1987; e para análise
glicosídica, o gel será corado com Schiff (Fairbanks et al., 1971).
Determinação de pH e
temperatura ótimos: O efeito do pH na atividade de fitase será
determinado incubando a enzima em tampões com diferentes valores de pH que
variam de 2,5 a 8,5 em tampão acetato de sódio, na concentração de 200 mmol/L-1.
O efeito da temperatura será determinado incubando a enzima em diferentes
temperaturas e no pH ótimo. As temperaturas testadas serão 30, 40, 45, 55 e 60 oC.
Efeito da
temperatura na estabilidade da enzima: As enzimas puras na
ausência do substrato por uma hora e trinta minutos nas temperaturas de 45 a 50
oC e a atividade residual será determinada a cada 15 minutos
de incubação.
Determinação de
KM e VMáx: As
propriedades cinéticas da fitase serão determinadas realizando-se o
ensaio nas condições descritas, variando-se a concentração de ácido fítico de
0,2 a 1,0 mmol/L-1. Os cálculos
dos valores das constantes serão feitos através do método de Michaelis-Mentem,
utilizando o programa Curve Expert 1.3.
Efeito de íons,
inibidores e agentes desnaturantes: o efeito de íons,
inibidores e agentes desnaturantes será determinado após a pré-incubação da
enzima com 2 mmol/L-1 CaCl2,
FeCl2, HgCl2, MgCl2 Cu(CH3COO)2,
(NH4)2SO4, BaCl2, EDTA e SDS por 5
minutos. A dosagem da atividade de fitase será de acordo com as descrições
citadas acima.
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Órgãos Financiadores: CNPq,
FUNAPE.