Pesquisa de anticorpos para lipoproteínas de mycoplasma hominis no soro de pacientes
com Artrite Reumatóide – RESULTADOS PRELIMINARES
Filiação: Departamento de Microbiologia, Imunologia,
Parasitologia e Patologia -IPTSP - Universidade Federal de Goiás; ‡Departamento de
Microbiologia –Universidade de São Paulo. E-mail: fdias@iptsp.ufg.br e rejarach@uol.com.br
Palavras-chave: Micoplasmas, artrite, lipoproteínas, anticorpos
INTRODUÇÃO: Os micoplasmas são bactérias sem parede celular
limitadas apenas por uma membrana plasmática trilamelar, que é composta de
lipídeos, proteínas, sendo a maioria como lipoproteínas e lipopolissacarídeos
não endotóxicos (Smith et al., 1976). Esses microrganismos induzem
respostas imunes específicas e são também ativadores policlonais inespecíficos
de linfócitos B e T, com subseqüente secreção de imunoglobulinas e citocinas.
Também ativam monócitos/macrófagos, aumentando a expressão das moléculas do
Complexo Principal de Histocompatibilidade, a produção de óxido nítrico e a
liberação de citocinas pro-inflamatórias (Simecka et al., 1993; Stuart,
1993; Ribeiro-Dias et al., 1999). Desta forma, os
micoplasmas causam doenças inflamatórias crônicas. Algumas espécies de
micoplasmas têm sido isoladas de fluido sinovial de pacientes com artrite,
entre elas: M. pneumoniae e M. genitalium, (Tully et al.,
1995), U. urealyticum (LEE et al., 1992) e M. hominis (Luttrell et al., 1994). Pesquisas têm sido
realizadas com o objetivo de demonstrar o envolvimento dos micoplasmas na
Artrite Reumatóide (AR), há mais de 30 anos. A AR é uma doença articular
inflamatória crônica, mediada por linfócitos T e macrófagos. Evidências do
envolvimento de micoplasmas na AR, bem como em outras doenças articulares
inflamatórias crônicas, têm sido demonstradas através da detecção de anticorpos
para micoplasmas no soro ou no fluido sinovial, bem como através do isolamento
ou identificação dos micoplasmas no fluido sinovial. Entre as espécies mais
frequentemente encontradas nos pacientes com AR estão M. fermentans, M. hominis,
M. pneumoniae e M. penetrans (Johnson
et al., 2000). OBJETIVO: pesquisar anticorpos para LAMPs de M. hominis em pacientes portadores de doenças articulares crônicas,
especialmente a AR. METODOLOGIA: Pacientes
foram triados no Ambulatório de Reumatologia do Hospital das Clínicas-HC/UFG,
sendo de ambos os sexos, faixa etária de 19 a 79 anos, com AR (n= 51), Lupus
Eritematoso Sistêmico (LES, n= 26) ou Espondilite Anquilosante (EA, n= 9).
Foram colhidos 10mL de sangue para obtenção do soro. Para controle, foram
separados os soros de 98 doadores do Banco de Sangue do HC/UFG. Somente foram
incluídos na pesquisa os pacientes que concordaram em participar
espontaneamente, assinando o Consentimento Informado (CEPMHA Protocolo No.
015/03). Mycoplasma hominis 1620 (BARILE et al., 1994) e M. hominis
PG21 (ATCC) foram centrifugados (12.000g, 50min, a 4˚C), o sobrenadante
foi desprezado e o sedimento ressuspendido em 40mL de tampão 1 (PBS pH 7,4 e
timerosal 0,025%), seguida de duas etapas de centrifugação (20.000g, 30 min,
4˚C). O sedimento foi ressuspendido em 4mL de tampão 2 (Solução Tris HCl
50mM; NaCl 150mM; EDTA 1mM, pH 8,0) e a esta suspensão foi adicionado 1mL de
Triton X-114 10% e a preparação foi submetida a 3 ciclos de sonicação (1 min, 2
mA, intervalos de 1 min, banho de gelo), sendo, em seguida acrescentados 5mL
Triton X-114 10% e 20mL tampão 2 de extração. Após incubação (3h, 4˚C),
sob agitação, a solução foi centrifugada (20.000g, 30 min, 4˚C), sendo o
sobrenadante (extrato) submetido à purificação por partição de fase. O extrato
foi incubado em banho-maria a 30˚C por 5 min e centrifugado a 2.500g (5
min, 29-30˚C). A fase detergente foi adicionada de igual volume de tampão
2 gelado e submetida novamente a partição por 2 vezes (Wang et al., 1992,
modificada). As LAMPs foram precipitadas com etanol absoluto por 24h (-20oC),
centrifugadas (50.000g, 1h, 4oC), ressuspendidas em PBS e
quantificadas através do BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, USA), usando
albumina para a curva padrão. As lamps
foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) baseada em
Laemmli (1970), sob condições
redutoras, utilizando um gel de corrida a 10%, sendo as lamps evidenciadas após coloração do gel com nitrato de
prata. O ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção de anticorpos para as lamps nos soros foi baseado em Cordova et al. (1999). As placas
de 96 poços foram sensibilizadas com diferentes quantidades de lamps (100mL,
18h, 4˚C), diluídas em tampão
carbonato/bicarbonato 0,06M, pH 9,6. As placas foram lavadas por 5 vezes com
solução A (PBS pH 7,4 e Tween 20 - 0,05%) e bloqueadas por 1h (37˚C) com
leite desnatado a 5%, em PBS pH 7,4. Após a lavagem do bloqueio, 100μL dos
soros a 1/50 em solução diluente (PBS pH 7,4, leite desnatado em pó a 2%) foram
adicionadas, em duplicatas, e incubadas por 18h (4˚C). As placas foram
lavadas novamente e o conjugado peroxidase anti-IgG (Bio Rad, 100μL, 1/2.000 em solução diluente) foi
adicionado. Após 60 min (37˚C), as placas foram lavadas novamente por 5
vezes. Em seguida, foram adicionados 100 μL de tampão substrato OPD (5mg
OPD, 5 mL de peróxido de hidrogênio
30V em 12,5mL de tampão citrato/fosfato, pH 5,1) e as placas foram mantidas à temperatura ambiente, protegidas da
luz, por 10 a 30min. A reação foi paralisada com 100μL de ácido sulfúrico
2N e a densidade óptica (D.O.) foi obtida em leitora de ELISA com filtro
de 492nm. Na padronização foi utilizado um fluido sinovial rico em anticorpos
para M. hominis 1620. Para
determinação do limiar de reatividade foram testados soros de 98 doadores
saudáveis. Foram consideradas positivas as amostras com leitura de D.O.³D.O. média destas amostras mais dois desvios padrões.
Teste c2 foi usado para comparações. RESULTADOS e DISCUSSÃO: A maioria das LAMPs extraídas e separadas
por eletroforese em gel de poliacrilamida, tanto do M. hominis 1620 quanto do M.
hominis PG21 tinham peso molecular entre 80 a 240. Poucas LAMPs foram
detectadas entre os pesos moleculares de 60 a 80. Na padronização do ELISA com
LAMPs de M. hominis 1620, as melhores
concentrações de antígenos foram 0,1 ou 0,2 mg/poço para a sensibilização das placas (0,1mg: D.O.= 1,09±0.05; 0,2mg: D.O.= 0,904±0.08; líquido sinovial 1/400; n=3). A
concentração de 0,2mg/poço
foi inicialmente utilizada para triagem dos soros. O ELISA utilizando soros
diluídos 1/50 mostrou que o limiar de reatividade, calculado para os 98
indivíduos saudáveis, foi de D.O. 0,208 (média + 2 desvios padrões). Assim, a
frequência de soros com imunoglobulinas G (IgG) para LAMPs foi de 3,06% para o
grupo controle, 3,92% para o grupo com AR, 11,54% para o grupo com LES e 11,11%
para o grupo com EA, não sendo atestadas diferenças estatisticamente
significativas entre estas freqüências. CONCLUSÕES:
Apesar dos dados sugerirem que não há diferença entre a freqüência de soros
reatores dos grupos controle e AR, quaisquer conclusões, por enquanto, são
inadequadas. O estudo está em fase de padronizações dos ensaios. Serão
extraídas LAMPs de M. fermentans e
realizado o immunoblotting.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
Suporte Financeiro: FUNAPE