Santos, F.B., Ulhoa, C.J.

O gênero Trichoderma compreende um grupo de fungos filamentosos encontrados no solo sobre matéria orgânica em decomposição e em raízes de várias espécies de plantas. Algumas espécies deste gênero, por serem antagonistas a outros fungos vêm sendo utilizadas no controle biológico de fungos fitopatógenos de interesse na agricultura. A espécie T. harzianum tem sido usada com sucesso como agente de controle biológico contra alguns fitopatógenos tais como Sclerotium rolfsi, Rizoctonia solani e Pythium spp. O gênero Trichoderma utiliza três mecanismos de antagonismo: a antibiose, com a produção de antibióticos voláteis e não voláteis; competição por espaço e nutrientes e micoparasitismo, mecanismo em que o Trichoderma secreta enzimas hidrolíticas que vão digerir a parede celular de outro fungo.

Entre as enzimas que degradam a parede celular do hospedeiro as quitinases e glucanases são as mais estudadas. As quitinases foram dividas por Sahai & Manocha (1993) em três grandes grupos: a) 1,4-b -N-acetilglicosaminidases (EC 3.2.1.30) que quebram a quitina liberando monômeros de N-acetil-D-glicosaminas; b) endoquitinases (EC 3.2.1.14) que clivam aleatoriamente a molécula de quitina em sítios internos, liberando oligossacarídeos; c) exoquitinases (EC 3.2.1.14) que catalisam a liberação progressiva de diacetilquitobiose, sem a liberação de mono e oligossacarídeos.

Para que o Trichoderma reconheça e ataque o outro fungo é necessário uma série de eventos seqüenciais, que vão desde o reconhecimento e contato com o hospedeiro, até expressão de genes específicos (Vasseur et al., 1995). Entretanto dados recentes demonstraram que a interação entre um micoparasita e seu hospedeiro é muito mais complexa do que se imagina, pois também envolvem mecanismos, não elucidados, de sinalização celular com participação de moléculas sinalizadoras tais como AMP cíclico (Omero et al., 1999).

Dados da literatura sugerem que a indução das enzimas citadas acima em T harzianum podem estar relacionados a uma resposta de um sinal extracelular. Firmino et al. (2002) trabalhando com o mesmo isolado de Trichoderma, mostraram que a indução da N-acetil-b -D-glicosaminidase foi inibida em 95% na presença de ALF₄^- 20 m M , 75% na presença de toxina da cólera (10 m g.mL^-1) e pertussis (20mg.mL^-1), 40 e 80% na presença de inibidores de fosfodiesterase IBMX (2 mM) e cafeína (5 mM), respectivamente. Em ambos trabalhos o perfil das proteínas secretadas por T. harzianum (T37), no meio contendo quitina, foi alterado de acordo com o modulador utilizado. Silva (2003) utilizando a reação da transcriptase reversa e amplificação por PCR (RT-PCR) demonstrou que existe uma diminuição na expressão do gene nag1 na presença de glicose e dos moduladores usados (cafeína, DNP, AlF₄). Dentre os moduladores testados, DNP foi que promoveu uma maior inibição da expressão do gene nag1. Estes dados sugerem que a regulação da síntese desta enzima, mediada pela variação dos níveis de AMPc, ocorre ao nível de transcrição.

Embora estes trabalhos mostraram que a expressão da N-acetil-b -D-glicosaminidases produzida por T. harzianum, é regulada pelos níveis intracelulares de AMPc, algumas questões importantes ainda permanecem sem respostas. Por exemplo, qual o efeito do AMPc na expressão das quitinases, visto que atuam em sinergismo com a N-acetil-b -D-glicosaminidase na hidrólise da quitina. O aumento dos níveis intracelulares de AMPc, mostrados por Silva (2003), influenciam de forma direta a expressão do gene nag1, ou esta diminuição da síntese se deve à repressão das quitinases, e consequentemente a produção de queda na produção de oligossacarídeos importantes na indução da N-acetil-b -D-glicosaminidase.

Este trabalho têm como objetivo avaliar a expressão das enzimas N-acetil-b -D-glicosaminidase quitinases e ß-glucanases produzidas por T. harzianum em meio contendo N-acetilglicosamina, quitina ou parede celular de Rizoctonia solani na presença de moduladores que aumentam os níveis intracelulares de AMPc.

Manutenção do fungo: O fungo Trichoderma harzianum (T37) proveniente da coleção do Laboratório de Enzimologia/Universidade Federal de Goiás será mantidos em placas, com repiques periódicos em meio MYG (p/v: 0,5% de extrato de malte, 0,25% de extrato de levedura, 1% de glicose e 2% de ágar) e estocados a 4° C (Ulhoa & Peberdy, 1992).

Produção de N-acetilglicosaminidase: Para este experimento serão inoculados 10⁷ esporos/mL de Trichoderma harzianum em frascos de 1,0 L contendo 250mL de meio TLE (g/L) segundo Ulhoa & Peberdy, 1993 ou outro indutor da N-acetilglicosaminidase. Os frascos serão incubados nas mesmas condições descritas neste item e após 72 horas o meio será filtrado em papel de filtro (Whatman nº 1) a vácuo e o sobrenadante guardado, após a adição de 0,02% de azida sódica e a determinação da atividade enzimática.

Dosagem de Proteínas: A concentração de proteína nas amostras será determinada pelo método de Bradford (1976) utilizando albumina sérica bovina (BSA-Sigma) como padrão.

Ensaio enzimático: A atividade de N-acetilglicosaminidase será determinada usando 100m L do substrato r -Nitrofenil-N-acetilglicosamina (r NP-AG), 50m L de sobrenadante contendo a enzima e 350 m L de tampão acetato de sódio 50 mM pH 6,0 e as condições de reação serão feitas de acordo com Yabuki et al., (1986).

Caracterização eletroforética em gel de poliacrilamida: Para a análise do perfil de proteínas secretadas pelo Trichoderma harzianum (T37) será utilizado o sistema de eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturante conforme descrito por Laemmli (1970).

Produção de Anticorpo (Anti-NAGase) policlonal: Uma alíquota de 250 m g de N-acetilglicosaminidase extraída e purificada de T. harzianum T37, será injetadas em coelho. A proteína pura será ressuspendida em 2mL de água ultrapura

Extração e dosagem de AMPcíclico: A concentração de AMPcíclico das células após a indução de N-acetilglicosaminidase (NAGase), será determinada utilizando o sistema de quantificação de AMPc (Amersham)Ò .

Avaliação da atividade quitinolítica dos extratos obtidos após a indução de N-acetilglicosaminidase na presença dos moduladores de transdução de sinal: A avaliação da atividade quitinolítica será feita de forma qualitativa. 60m L de enzima proveniente da indução será incubadas por 1 hora em eppendorf a 37°C com 5m L de N,N’,N",N’’’tetracetilquitotetroseose ou N,N’,N" -triacetilquitotriose 4mM e 20m L de tampão acetato 50mM pH 5,5. Os açúcares redutores serão dosados por DMAB e a absorbância medida a 585nm.

Análise molecular:

Extração de DNA: será utilizado o método de CTAB proposto por Zolan & Pukilla (1986). O fungo T. harzianum (T37) será crescido em meio líquido MYG e depois feito a extração de seu DNA. Amplificação do DNA genômico do Fungo T. harzianum será feita através da Reação em Cadeia da Polimerase.

Extração de RNA: Todos os procedimentos envolvendo a manipulação de RNA serão realizadas em condições livres de RNAses. Após a realização dos experimentos de indução em diferentes meios de indução com diferentes moduladores os micélios, serão submetidos à extração de RNA total pelo método de TRIZOL (GICO-BRLÒ ).

Northern blot: Ensaios de Northern blot segundo Fourney et al., (1988) serão realizados para avaliar os níveis de transcritos utilizando Hyperfilm^TM ECL.

Westen blot: A detecção de proteínas pelos anticorpos produzidos segundo descrito acima será realizada em membrana de nitrocelulose segundo

Bibliografia:

FIRMINO, A. A. P. (1998). Transdução de Sinais em Trichoderma harzianum: Aspectos da Indução da Atividade de N-acetilglicosaminidase. Tese de mestrado.Universidade de Brasília, Brasília, Bra.

Kubiceik, C. P., Harman, G. E. (1998). Trichoderma and Gliocladium Vol 1, 1º Ed, Taylor & Francis, London UK

Kubiceik, C. P., Harman, G. E. (1998). Trichoderma and Gliocladium Vol 2, 1º Ed, Taylor & Francis, London UK

OMERO, C., INBAR, J., ROCHA-RAMIREZ, V., HERRERA-ESTRELA, A., CHET, I. & HORWITZ, B. A. (1999). G proteins activators and cAMP promote mycoparasitic behavior in Trichoderma harzianum. Mycol. Res. 103(12): 1637-1642

SAHAI, A. S. & MANOCHA, M. S. (1993). Chitinases of fungi and plants: their involvement in morphogenesis and host-parasite interaction. FEMS Microbiol. Rev.11: 317-338.

Silva, R. N. (2003). Aspectos moleculares da indução de N-acetil-ß-D-glicosaminidase. Tese de mestrado. Universidade Federal de Goiás, Goiânia-Go, Bra.

VASSEUR, V., VAN MONTAGU, M. &GOLDMAN, G. H. (1995). Trichoderma harzianum genes induced during growth on Rhizoctonia solani cell walls. Microbiology 141: 767-774