Investigação “in vitro”
dos efeitos dos extratos da folha e da casca de pequi (Caryocar brasiliensis)
VELOSO,
V.S1,2.; SILVA, M.G1.; YAMADA, A. T 2. &
SABÓIA-MORAIS, S.M.T1.
Palavras-chave: extratos de pequi, cultura
de células, citotoxicidade, proliferação celular
A utilização medicinal das
plantas do Cerrado é feita pela extração de componentes encontrados nas raízes,
caules e folhas. Espécies vegetais nativas do Cerrado que são pertencente aos
gêneros Eugenia, Hyptis, Solanum, Annona,
Stryphnodendron, Caryocar e Ingá são
largamente utilizadas na medicina popular e, são de grande interesse econômico
regional (Almeida et al., 1998).
Uma planta
típica desse bioma é uma frutífera, o Caryocar
brasiliensis Camb.(Caryocaraceae), conhecido vulgarmente por “pequizeiro”,
a qual é uma planta muito versátil, no que diz respeito às suas utilidades,
pois dela se aproveita praticamente tudo. (Lopes et al., 2003).
Por meio de
análise cromatográfica realizada por Rosa et
al.,(2004), verificou-se uma diferença significativa entre substâncias
presentes no extrato bruto de folhas e o extrato bruto de cascas de pequi (Caryocar brasiliensis). No extrato bruto
da folha, cuja composição provavelmente é responsável pela sua ação antifúngica
já observada (Passos et al., 2002),
foram encontrados açúcares, carotenos, clorofila, flavonóides glicosilados,
taninos condensados e taninos hidrolisáveis, ao passo que no extrato bruto da
casca do caule observou-se a presença de açúcares, cumarinas, flavonóides
glicosilados e taninos condensados.
Nas plantas,
os taninos podem ser encontrados em raízes, flores, frutos, folhas, cascas e na
madeira, atuando para protegê-las contra os herbívoros e na prevenção aos
diferentes patógenos. A complexação entre taninos e proteínas é a base para
suas propriedades como fatores de controle de insetos, fungos e bactérias o que
lhes confere alto potencial para atividades farmacológicas (Simões et al.,
2004).
Estratégias
científicas para a avaliação de produtos naturais in vitro com atividade biológica têm apresentado avanços
significativos nos últimos anos, em decorrência dos crescentes interesses no
aproveitamento de produtos naturais. Levando-se em consideração de que estudos “in vivo” podem sofrer interferências intrínsecas do animal
teste de maneiras diversas, nem sempre previsíveis nas respostas esperadas, o
estudo sistemático “in vitro” é tido como imprescindível.
Dentre as respostas celulares chaves à exposição a
tóxicos é a indução da proliferação celular, que representa uma das mais
relevantes funções celulares e pode ser usada como indicador de citotoxicidade
em cultura de células (Kilemade et al.,
2002; Rosa et al.,
2004).
O objetivo geral deste estudo será avaliar
comparativamente a ação moduladora tempo- e concentração-dependente dos
compostos presentes nos diferentes extratos obtidos do pequi, sobre a
capacidade proliferativa das células HeLa (modelo celular epitelial maligno) e
MDCK (modelo celular epitelial normal), que são classificadas como tendo
capacidade proliferativas alta e moderada, respectivamente. Essa análise se
realizará por meio de tratamentos agudo, subagudo e crônico das células “in
vitro”. Os objetivos específicos consistem em verificar a manutenção da
capacidade celular por meio do teste MTT, identificar o retorno à bioatividade
normal por meio de repique, diagnosticar o efeito proliferativo em relação à
manutenção da estrutura celular normal e analisar estatisticamente através do
teste de ANOVA o efeito das substâncias sobre as células.
2. Materiais e Métodos
As folhas e as cascas do caule de pequi (Caryocar brasiliensis) serão coletadas
em um sítio próximo a Goiânia, Goiás, procedendo-se, então, à obtenção dos
extratos, quando as mesmas serão submetidas, separadamente, à secagem em estufa
de ventilação forçada e trituradas.
Obter-se-ão o extrato etanólico da folha e da casca do caule de pequi e o
extrato polifenólico da folha e da casca do caule do pequi, designados como EEf
, EEc, EPf e EPc, respectivamente.
O cultivo das células HeLa e MDCK será feito em meio Eagle´s modificado de
Dulbecco´s, suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico
antimicótico, sendo as mesmas mantidas em uma temperatura de 37oC a
uma atmosfera de 5% de CO2 até o início dos ensaios.
Os ensaios in
vitro consistirão em expor as células da linhagem HeLa e da linhagem MDCK ao
extrato etanólico da folha e da casca do caule de pequi e ao extrato
polifenólico da folha e da casca do caule desta mesma planta. Ambas as
linhagens serão analisadas sob o efeito de 20 mg/l e 100mg/l dos extratos acima relacionados no período de 30, 60 minutos, 6, 24 e
48 horas. Os
controles serão realizados com os cultivos em iguais condições nos referidos
tempos, sem a adição de qualquer extrato. Os ensaios com os respectivos
controles serão realizados em triplicata.
As células HeLa e MDCK após submetidas às diferentes
condições de cultivo, serão submetidas à reação imunocitoquímica com anti-PCNA
e reveladas pelo método de imunoperoxidase. Serão quantificadas as incidências
de núcleos marcados e analisadas estatisticamente quanto às possíveis
diferenças entre os tratamentos com extratos EEf, EEc, EPf e EPc.
Após os
períodos estabelecidos de exposição das células HeLa e MDCK aos extratos
referidos, será realizado o método de redução MTT-tetrazólio. O MTT é clivado pelo sistema redutase
succinato-tetrazólio, que pertence à cadeia respiratória mitocondrial e é ativo
em células vivas. O MTT é inicialmente adicionado ao meio, e em seguida
removido, adicionando-se posteriormente ao meio de cultura dimetilsulfóxido, para leitura
de absorbância em 560nm para cada um dos ensaios.
Por fim, os meios de cultura serão
removidos, e avaliados quanto à liberação da enzima desidrogenase lática (LDH).
Em cada uma das amostras será adicionada solução de piruvato de sódio recém
preparada em tampão fosfato 100mM, pH 7,4 e incubadas a 37oC durante
30 minutos, para leitura espectrofotométrica.
3. Resultados esperados e Discussão
Foram realizados estudos “in vivo” por Rosa et al.,(2004), utilizando como modelo
experimental guarus. Quando estes animais foram expostos ao extrato casca do
caule de Caryocar brasiliensis a 20mg/l, houve um
aumento quantitativo das células branquiais.
Neste trabalho nós esperamos encontrar aumento proliferativo
das células normais expostas aos extratos bioativos do pequi, e que esta
proliferação seja benéfica, ou seja, uma possível ação estimuladora do processo
de cicatrização e regeneração celular. Caso este resultado seja obtido,
poder-se á especular sobre a possibilidade dos extratos de pequi com
reatividade positiva serem utilizados como fármacos em doenças de pele, o que
necessitará de estudos posteriores mais aprofundados.
Keil et al., 2004,
observou que os taninos inibiram o crescimento e promoveram apoptose de células
cancerosas, mas não de suas correspondentes normais. Assim, para as células
malignas esperamos encontrar o efeito inverso ao relatado para as células
normais.
4. Conclusão
O uso medicinal do pequi (Caryocar brasiliensis) pela população de
diferentes partes do Brasil tem encontrado respaldo nos estudos científicos,
que comprovam a eficácia destas plantas em vários modelos experimentais. Neste
contexto, alguns efeitos biológicos ou farmacológicos, como antifúngicos,
moluscicida, anticancerígeno, etc., são relatados na literatura, comprovando e
justificando o uso desta espécie na medicina popular e, demonstrando o
potencial medicinal das substâncias encontradas no pequizeiro. Tais dados se
comprovados poderão não só indicar os efeitos curativos desta planta, como
agregar-lhe valor, indicando a necessidade urgente de preservação do bioma
Cerrado.
5. Referências bibliográficas
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ROSA, E.V.; SANTOS, S,C.; MORAIS,
J.O.R.; SABÓIA-MORAIS, S.M.T. (2004). Bioactivity of etanolic extracts of pequi (Caryocar brasiliensis) promoting cell
prolifferation revelled through 5-bromo-2-deoxyuridina in gills of fish (Poecilia vivipara). Submetido –
J.Fish Biology. (BUSCAR TÍTULO EM
INGLÊS)
Fonte de financiamento: CAPES