AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE FOTOTÓXICA IN VITRO DE FURANOCUMARINAS EM CÉLULAS DE MELANOMA HUMANO E FIBROBLASTOS HUMANOS NORMAIS

LEITE, V.C., ¹ BRETAS, M.L.², SANTOS, R.F.³, GUILLO, L.A.⁴

^1,2,4Instituto de Ciências Biológicas, ³Instituto de Química, Universidade Federal de Goiás, Goiânia – GO ; andreuguillo@aol.com; vanessacarneiroleite@hotmail.com

1. INTRODUÇÃO

As furanocumarinas mais comumente conhecidas como psoralenos são agentes farmacológicos, isolados de plantas³. Os psoralenos tem sido extensivamente estudados pelas suas propriedades fototóxicas, tanto in vitro quanto in vivo. Essas propriedades envolvem a interação com proteínas, lipídios de membrana e formação de mono ou biadutos com o DNA. As lesões a nível de DNA são responsáveis pelo efeito antiproliferativo e pela ação terapêutica dos psoralenos.⁴ Atualmente alguns derivados de psoralenos sintéticos tais como 4,5’,8-trimetilpsoraleno, 8-metoxipsoraleno e 7-metilpirido(3,4-c)psoraleno, em combinação com radiação UVA (terapia PUVA), são empregados terapeuticamente no tratamento de desordens proliferativas da pele como em psoríase e vitiligo. O psoraleno 7-metilpirido(3,4-c)psoraleno, ainda não é empregado terapeuticamente.³ A estrutura desses psoralenos está mostrada na figura 1. O exato mecanismo molecular responsável pela eficácia da terapia PUVA, ainda é um assunto em debate.

Figura 1: Fórmula estrutural das furanocumarinas estudadas

Modificações no DNA podem representar um modo de ação terapêutica. Acredita-se que após a absorção de energia (luz UVA), a molécula de psoraleno forma mono e biadutos, ocorrendo mais freqüentemente com a base timina do DNA.² O processo de formação de mono e biaduto depende da estrutura do psoraleno, da seqüência de base do DNA e da dose da radiação usada para a fotocicloadição. O arranjo geométrico das furanocumarinas lineares durante a intercalação não-covalente, pode influenciar enormemente a reação de fotocicloadição.⁵

Palavras-chave: furanocumarinas, fototoxicidade, in vitro, fotocicloadição

2. OBJETIVO

O presente trabalho teve como objetivo geral avaliar o efeito antiproliferativo das furanocumarinas: 8-metoxipsoraleno, 4,5’,8-trimetilpsoraleno e 7-metilpirido(3,4-c)psoraleno em células de melanoma humano comparativamente às células de fibroblastos humanos normais em cultura.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 – Cultivo de células de melanoma humano e fibroblastos humanos normais

As células da linhagem SKMEL 37 empregadas neste estudo, foram mantidas em frascos de cultura de 75 cm² e em meio MEM (Sigma Chemica Co., St, Louis, USA) suplementados com 10% de soro fetal bovino (Cutilab, Campinas, Brasil), penicilina e fungizona. As células de fibroblastos humanos normais foram mantidas em condições de cultura semelhante à cultura de melanoma, o meio usado para esse tipo de célula, foi o meio DMEM.

3.2 – Tratamento de melanoma humano e fibroblastos humanos normais com cisplatina

Para o tratamento com cisplatina, procedeu-se a adição de diferentes concentrações, as células foram incubadas por 3 horas em salina HBSS com Ca²⁺, após esse período, retirou-se o meio, acrescentando meio de cultura adequado. Após período de 24, 48 e 72 horas foi realizado o ensaio MTT.

3.3 – Tratamento de melanoma humano e fibroblastos humanos normais com psoralenos

As células de melanoma humano (linhagem SKMEL 37) e fibroblastos humanos normais foram mantidas em cultura, incubadas com diferentes concentrações de 8-MOP e TMP, irradiadas com luz UVA (0,3J/cm²) e coletadas, para análise, em intervalos de 24, 48 e 72 horas. O efeito antiproliferativo do psoraleno MPP somente foi observado em células de melanoma humano. A fototoxicidade de 8-MOP, TMP e MPP, foi analisada pela medida da atividade de desidrogenase mitocondrial (método do MTT).

3.4 – Metodologia utilizada na modelagem molecular de psoralenos

A estrutura das furanocumarinas estudadas foi construída e visualizada usando um modelo interativo construído pelo pacote computacional TITAN, versão 1.0 da Wavefunction, Inc. Os cálculos foram efetuados em uma Workstation Dell, modelo Precision 220.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

O fármaco cisplatina foi utilizado como controle positivo e a concentração inibitória (IC₅₀) 24 horas após o tratamento foi de 21,06±0,004 µmol.L^-1 em células de melanoma humano e 46,18±0,007 µmol.L^-1 em células de fibroblastos humanos normais. A furanocumarina TMP apresentou especificidade in vitro (IC₅₀ = 0,28±0,005 µmol.L^-1) por células de melanoma humano comparativamente a fibroblastos humanos normais (IC₅₀ >>500±0,046 µmol.L^-1) 24 horas após o tratamento. Os valores de IC₅₀ para células de melanoma humano obtidos 72 horas após o tratamento com os derivados de psoralenos foram: MPP = 0,045±0,005 µmol.L^-1, TMP = 0,059±0,002 µmol.L^-1, 8-MOP = 9,69±0,002 µmol.L^-1, e para fibroblastos normais foram: TMP = 0,097±0,005 µmol.L^-1 e 8-MOP = 3,8±0,003 µmol.L^-1. De acordo com os valores de IC₅₀ obtidos a ordem de fototoxicidade observada foi MPP>TMP>8-MOP. Os coeficientes de partição das furanocumarinas no sistema octanol/água foram calculados no programa computacional TSAR e a ordem de lipofilicidade encontrada foi: MPP>TMP>8-MOP. Esses dados estão de acordo com a ordem da fototoxicidade observada. Através do programa computacional TITAN foi possível constatar que a formação de monoadutos TMP e 8-MOP com a timina ocorre preferenciavelmente no sítio 3,4 do anel pirano. O biaduto de TMP-timina, é mais estável (∆H_f = -89,29 kcal/mol). O monoaduto MPP-timina apresentou maior estabilidade (∆H_f = -58,226 kcal/mol) em relação ao monoaduto formado por 8-MOP-timina (∆H_f = -16,78 kcal/mol), o que poderia estar relacionado com a alta fototoxicidade in vitro.

5. CONCLUSÃO

Analisando os resultados obtidos no presente trabalho, concluímos que as células de melanoma humano da linhagem SKMEL 37 responderam ao tratamento in vitro com cisplatina, validando o estudo com furanocumarinas. E que as furanocumarinas estudadas apresentam efeito antiproliferativo in vitro sobre células de melanoma humano e fibroblastos humanos normais, e esse efeito é dependente da estrutura e da lipofilicidade dos derivados de psoralenos.

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. COLOMBAIN, M., GOLL, V., MUYARD, F., GIRARD, C., BÉVALOT, F., RICHERT, L. A biossay using the human hepatoblastoma cell line HepG2 for detecting phototoxicity of furanocumarins. Plant Med, v. 67, p. 644-646, 2001.

2 - DIAWARA, M.M., TRUMBLE, J.T. Linear furanocoumarins. In: FELIX D’MELLO, J.P.(ed). Handbook of plant and furgal toxicants, 1997.

3- GOODMAN, A., e GILMAN. As Bases Farmacológicas da terapêutica. Traduzido por Lauro Sollero, 5 ed., Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 1996.

4- LUFTL, M., ROCKEN, M., PELWIG, G., DEGITZ, K. PUVA inhibits DNA replication, but not gene transcription at nonlethal dosages. The Society for investigative Dermatology, Inc, v. 111, p. 399-405, 1998.

5 – MACHADO, A.E.H., MIRANDA, J.A., OLIVEIRA-CAMPOS, A.M.F., SEVERINO, D., NICODEM, D.E. Photophysical properties of two new psoralen analogs. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, v. 146, p. 75-81, 2001.