Caracterização bioquímica de lipases produzidas por Trichoderma harzianum.

MARTINS, S.G.; ULHOA, C. J.

Laboratório de Enzimologia – Instituto de Ciências Biológicas - Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular. e-mail: sejanamartins@bol.com.br / ulhoa@icb.ufg.br

RESUMO

O fungo filamentoso Trichoderma harzianum são fungos filamentosos, saprófitas e descrito como um agente de controle biológico utilizado contra alguns fitopatógenos. São comuns no solo do cerrado brasileiro e um dos mecanismos de antagonismo deste fungo é denominado micoparasitismo e se caracteriza pela produção de enzimas hidrolíticas, responsáveis pela quebra da parede celular do fungo hospedeiro. Considerando o potencial de fungos do gênero Trichoderma em produzir enzimas de interesse biotecnológico, é nosso objetivo neste trabalho, avaliar a produção de lipase por isolados de Trichoderma harzianum (ALL 52), bem como purificar e caracterizar a enzima produzida. A atividade de lipase será avaliada, após crescimento dos fungos por 6, 12, 24, 48 e 72 horas a 28°C e 140 rpm, utilizando como fonte de carbono óleos vegetais (oliva, milho, soja e sardinha). Para análise do perfil de proteínas secretadas no meio de cultura será utilizado um sistema de eletroforese (MiniGel-Sigma) em gel de poliacrilamida 10% em condições desnaturantes, SDS-PAGE e para a purificação da lipase produzida, métodos de cromatografia baseados em troca iônica, filtração em gel e interação hidrofóbica serão utilizados, entretanto, a melhor metodologia a ser utilizada neste trabalho ainda será avaliada.

Palavras-chave: Lipase; Trichoderma harzianum; Controle biológico.

INTRODUÇÃO

O fungo filamentoso Trichoderma harzianum é descrito como um agente de controle biológico utilizado contra alguns fitopatógenos (Hjeljord & Tronsmo, 1998; citado por Lima 2002), tais como Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani e Pythium sp. Um dos mecanismos de antagonismo deste fungo é denominado de micoparasitismo, onde, acredita-se que ocorra através de vários eventos que vão desde o reconhecimento e contato direto. Este mecanismo se caracteriza pela produção de enzimas hidrolíticas, como quitinases (EC. 3.2.1.14) e N-acetilglucosaminidase (EC. 3.2.1.30), responsáveis pela quebra da parede celular do fungo hospedeiro. As enzimas do sistema quitinolítico e as β-1,3-glucanases produzidas por isolados de Trichoderma sp. (Ulhoa & Peberdy, 1992; Lorito et al.1993; Haran et al; 1996), tem sido comparadas como as principais hidrolases envolvidas no processo de micoparasitismo. Tendo em vista o grande número de enzimas hidrolíticas produziadas por estes fungos, o objetivo deste trabalho é avaliar a produção de lipases por isolados de Trichoderma harzianum (ALL 52), bem como purificar e caracterizar a enzima produzida.

As lipases {(E.C.3.1.1.3) triacilglicerol acilhidrolases} são enzimas que catalisam a hidrolise total ou parcial de triacilglicerol (TAG), liberando como produto diacilglicerol (DAG), monoacilglicerol (MAG), glicerol e ácidos graxos livres (Carvalho et al, 2003). Estas enzimas encontram-se largamente distribuídas na natureza em animais, vegetais e microrganismos. Entretanto, lipases produzidas por microrganismos são as mais utilizadas industrialmente porque além de apresentarem procedimentos mais simples de isolamento a partir do caldo fermentativo são, geralmente, mais estáveis e com propriedades bem mais diversificadas que as lipases de outras fontes. São em sua maioria, extracelulares, favorecendo sua extração, isolamento e purificação (Saxena et al., 2003). Sua importância deve-se a sua utilidade como catalisadores no procedimento de óleos e gorduras, nas industrias de detergentes, alimentos, papeis, cosméticos, farmacêuticos e química fina (síntese orgânica), (Rubin & Dennis, 1997, citado por Majewski, 2004).

As vantagens de se utilizar a enzima lipase deve-se principalmente, a sua disponibilidade comercial, baixo custo de produção, versatilidade catalítica por não requerer cofatores, por serem quimio e enantiosseletiva, regioespecifica para a posição 1,3 de TAGs e atuarem em faixa ampla de pH e temperatura (João et al, 2000; citado por Majewski, 2004). Neste sentido, novas tecnologias alternativas tem gradualmente surgido frente a importância das lipases nos processos industriais, determinando estratégias de purificação que são de baixo custo, rápidas e que permitam operação em larga escala.

MATERIAIS E MÉTODOS

Manutenção do fungo: Os isolados Trichoderma harzianum ALL-52 da Coleção do Laboratório de Enzimologia / UFG, serão mantidos com repicações periódicas em meio MYG (0,5% de extrato de malte, 0,25% de extrato de levedura, 1% de glicose e 2% de ágar) e estocado a 4°C.

Produção de Enzimas: Esporos das culturas dos isolados de Trichoderma harzianum ALL-52, serão inoculados em frascos de 250 mL contendo 25 mL de meio de TLE composto por: 1g/L de bactotriptona, 0,3g/L de uréia, 2,0g/L de KH₂PO₄, 1,4g/L de (NH₄)₂SO₄, 0,3g/L de MgSO₄.7H₂O, 0,3g/L de CaCl₂.6H₂O e solução de elementos traços; suplementado com 0,5% de substrato (óleos vegetais) a ser testado como indutor. Os frascos serão incubados em agitador rotatório à 28°C e velocidade de 140 rpm. Após 12, 24 e 72 horas de incubação o sobrenadante será coletado e utilizado como fonte de enzimas.

Atividade Enzimática: A atividade de lipase será determinada segundo metodologia descrita por Heinoen e Lahti (1980), utilizando óleo vegetal como substrato.

Determinação de Proteína: A concentração de proteínas nas amostras será dosada pela métodologia descrita por de Lowry et al.(1951), utilizando albumina bovina como padrão.

Caracterização eletroforética: Para análise do perfil de proteínas secretadas no meio de cultura será utilizado um sistema de eletroforese (MiniGel-Sigma) em gel de poliacrilamida 10% em condições desnaturantes, SDS-PAGE (Laemmli, 1970). A corrida deverá ser feita a uma voltagem inicial de 80V e amperagem de 40mA, posteriormente aumentada para 150 Volts. Os marcadores utilizados para determinação da massa molecular deveráo ser: fosfolipase, soroalbumina bovina, ovoalbumina e anidrase carbônica.

Determinação de pH e temperatura ótimos: O pH ótimo para a atividade da lipase deverá ser realizado incubando a enzima purificada em tampão tris HCL 700 mM, com valores de pH variáveis de 2.8 a 8,0. O efeito da temperatura será determinado incubando a enzima em diferentes temperaturas e no pH ótimo.

Efeito da temperatura na estabilidade da enzima: O efeito da temperatura na estabilidade da enzima purificada será determinada após pré-incubação da enzima a 40, 50 ou 55°C, em tampão Tris HCL 700 Mm, pH 8,0 por 10, 15, 30, 45, 60 e 90 minutos.

Determinação de K_M e V_Máx: As propriedades cinéticas da lipase serão determinadas realizando-se o ensaio nas condições descritas anteriormente, variando-se a concentração de óleos vegetais. A velocidade da reação será expressa em nmol de p-nitrofenol e ácidos graxos liberado por minuto. Os cálculos dos valores das constantes serão realizados através do método de Michaelis-Menten, utilizando-se o programa Curve Expert 1.3.

Efeito de íons, inibidores e agentes desnaturantes: O efeito de íons e reagentes na atividade da lipase será determinada após a pré-incubação com 5 mmol. L^-1 dos seguintes compostos: EDTA, HgCl_2, CaCl₂, KCl, FeCl₂, , MgCL₂, , (NH₄)₂SO₄, BaCL₂, MnCL₂, CuSO₄, CuCl₂ ZnSO₄, LiSO₄, MgSO₄ e SDS nas concentrações de 100mM. Após este tempo de incubação, será acrescentado 0.4 mL de substrato. A dosagem da atividade de lipase será de acordo com as descrições citadas acima.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

CHET, I.; BERNHAMOU, N.; HARMAN, S. Mycoparasitis and lytic enzymes. In: HARMAM, G.E.; KUBICEK, C.P. (ed) Trichoderma & Gliocladium : Enzymes, biological control and commercial applications. Taulor & Francis Ltda. 1998. V. 2.

FIRMINO, A.A.P.; Transdução de Sinais em Trichoderma harzianum: Aspectos da indução da atividade de N-acetilglicosaminidase. Brasília – DF. UNB. 1998

LIMA, A.L.; Caracterização morfológica, molecular e bioquímica de Trichoderma spp isolados de solo do cerrado brasileiro. Brasília – DF. UNB. ICB / Departamento de Fitopatologia. Imprensa Universitária. 2002. 73p. (Tese de Doutorado).

MAJEWSKI, R.; Produção da enzima lipase do fungo Criptococcus flavus, sua imobilização química em sílica gel-preparação e propriedades. 2004. 16p, 23p 26p 51p. (Tese de doutorado).

N.R. KAMINI et al.; Production, purification and characterization of an extracellular lipase from the yesat, Cryptococcus sp. S-2. 317-324p. 2000.

R. Sharma et al.; Production, purification, characterization, and applications of lipases. Biotecnology Advances 19. 627-662p. 2001.

R. K. Saxena et al.; Purification strategies for microbial lipases. 1-18p. 2002.

ULHOA, C.J.; PEBERDY, J.F.; Effect of carbon sources on chitobiase production by Trichoderma harzianum, Mycological Research, 97 (1), 45-48 (1993).

Órgãos Financiadores: CNPq, FUNAPE.