Instituições de origem: *Laboratório de Comportamento Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás ; ** Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia ; *** Laboartório de Produtos Naturais, Instituto de Química, Universidade Federal de Goiás.

Palavras-Chave: Toxicidade, Frações de Pequi, Tambaqui e Hematócrito.

A biodiversidade de espécies vegetais do Cerrado é enorme e o potencial de pesquisa científica igualmente vasto. Muitos estudos têm demonstrado que a avaliação da bioatividade de plantas medicinais do Cerrado fornece subsídios para utilizá-las como fármacos pelo homem (Vieira & Martins, 1998). Dentre estas espécies encontra-se o pequi (Caryocar brasiliensis).

Bezerra et al. (2002) verificaram a ação moluscicida dos extratos da folha e casca do caule de pequi (Caryocar brasiliensis). Este estudo teve o propósito de verificar uma possível erradicação da esquistossomose através da eliminação do molusco Biomphalaria glabrata, hospedeiro intermediário do parasito Schistossoma mansoni, causador da esquistossomose. Como resultado encontraram uma mortalidade de 90% do molusco Biomphalaria glabrata, a partir de 12 horas de exposição aos extratos da folha e casca do caule de pequi. Desta forma, estes extratos seriam utilizados próximos a mananciais de água, provável nicho ecológico destes moluscos.

Porém, análises laboratoriais complementares se faziam necessárias para verificar a bioatividade destas substâncias frente a outros organismos aquáticos. Silva et al. (2003), utilizando frações dos extratos da folha e casca do caule de pequi, verificaram que estas não são letais a peixes da espécie Poecilia vivipara, na concentração de 20 ppm, com exceção a fração aquosa da folha. Porém, mesmo não causando a mortalidade dos peixes, algumas frações provocaram aumento da densidade numérica de células branquiais. Além disso, Silva et al (2003) verificaram uma aparente vasodilatação nas lamelas branquiais dos peixes expostos a frações acetato de etila da casca do caule de pequi. Esta observação pode estar caracterizando uma reação fisiológica contra um possível agente tóxico.

Uma variedade de poluentes químicos pode induzir anemia, reduzindo a síntese de hemoglobina, malformação e rompimento de eritrócitos e outros. Alguns estudos têm utilizado parâmetros hematológicos para demonstrar a toxicidade de certas substâncias frente a organismos aquáticos como peixes. Intensa toxicidade a nitrito foi demonstrada em tambaqui (Colossoma macropomum) utilizando-se parâmetros hematológicos como indicadores (Costa et al., 2000).

Affonso et al. (2002) verificaram que respostas fisiológicas, como mudanças nos níveis metabólicos sanguíneos, induzidas por sulfeto em tambaqui (Colossoma macropomum) assemelham-se àquelas induzidas por hipóxia ambiental. O número de eritrócitos e a concentração de hemoglobina celular aumentam em tambaquis expostos a sulfeto e também à hipóxia, entre 12 e 24 horas, sugerindo um aumento na capacidade sanguínea de transporte de oxigênio, provavelmente causado pela contração do baço. Porém, após 96 horas estes parâmetros diminuem consideravelmente no grupo exposto a sulfeto, caracterizando uma anemia provavelmente causada pela substância tóxica a qual os peixes foram expostos.

Desta maneira, objetiva-se com este projeto de pesquisa analisar morfometricamente os vasos sanguíneos presentes nas brânquias, fígado e rins do tambaqui (Colossoma macropomum) expostos à fração acetato de etila da casca do caule de pequi (Caryocar brasiliensis) bem como analisar também os parâmetros e metabólitos sanguíneos presentes nestes peixes após exposição à fração. Espera-se encontrar uma vasodilatação nas brânquias, como já observada em outras espécies de peixes (Silva et al., 2003), porém pretende-se observar se esta vasodilatação é local ou sistêmica, analisando outros órgãos como fígado e rins. A análise dos metabólitos e parâmetros sanguíneos poderá indicar se esta fração é realmente prejudicial à homeostase do peixe e se poderá ou não ser utilizada em mananciais d’água para combater a esquistossomose, sem prejudicar outros organismos aquáticos.

As frações utilizadas serão obtidas no Laboratório de Produtos Naturais do Instituto de Química da UFG. Para tanto, a casca do caule passará por secagem, moagem, perculação a frio em etanol 96%, filtração do sobrenadante e evaporação do solvente à pressão reduzida, que conduzirá ao extrato bruto etanólico. Parte do extrato bruto será diluído em água destilada e se acrescentará éter etílico resultando em uma proporção 1:1. Separação por polaridade conduzirá a fração etérea, enquanto que a porção aquosa será transferida para outro funil de separação e se acrescentará acetato de etila (1:1), o que resultará na fração acetato de etila. A fração acetato de etila será evaporada, submetida ao congelamento e, finalmente liofilizada.

Jovens tambaquis serão mantidos por 3 semanas em tanques fechados para aclimatização. Três grupos de 25 tambaquis cada serão transferidos para três aquários de 200 litros e permanecerão intactos por 24 horas. Os peixes em cada aquário serão submetidos as seguintes condições:

Grupo Controle 1: permanecerão em condições físico-químicas padrões para o cultivo da espécie.

Grupo Controle 2 : os peixes serão expostos apenas ao acetato de etila, na mesma concentração que esta substância apresenta na fração acetato de etila do caule de pequi.

Grupo Experimental: os peixes serão expostos a fração acetato de etila da casca do caule de pequi na concentração de 20 ppm.

Cinco peixes de cada grupo serão removidos após 2, 12, 24, 48 e 96 horas. Amostras de sangue serão retiradas através da veia caudal utilizando-se seringas. Amostras das brânquias, fígado e rins serão retiradas dos peixes removidos após 2, 24 e 96 horas, para análise morfométrica dos vasos sanguíneos.

Amostras sanguíneas serão divididas em três alíquotas e colocadas em banho de gelo durante todas as análises (2h). O pH sanguíneo será determinado imediatamente. Uma das alíquotas será usada para hematologia. O hematócrito (Ht) será determinado pela técnica de centrifugação. A contagem de eritrócitos (RBC) será determinada opticamente. A concentração de hemoglobina ([Hb]) será determinada com reagentes Drabkin´s com absorbância de 540nm. O volume celular médio (MCV), hemoglobina celular média (MCH), e a concentração celular de hemoglobina média (MCHC) serão calculadas a partir do Ht, [Hb] e RBC.

Uma segunda alíquota da amostra sanguínea será analisada para se identificar a concentração de lactato e uma terceira alíquota da amostra sanguínea será analisada para se identificar a presença de glucose.

As amostras de tecido (brânquias, fígado e rins) serão fixadas em Karnovsky modificado (gluteraldeído a 2%; solução de paraformaldeído a 4% em tampão fosfato de sódio pH 7,2 - 0,1M). O material será desidratado em concentrações crescentes de etanol e incluído em historresina (LKB-2218). Cortes de 4 micrômetros de espessura serão corados em Azul de Toluidina a 1%. Serão confeccionadas 5 lâminas de cada animal para cada órgão.

Medidas de densidade e volume dos vasos sanguíneos em corte transversal, presentes no material histológico analisado, serão obtidas através de um analisador de imagens (IMAGELAB versão 2.3). Para isso serão determinados os diâmetros do lúmen interno dos vasos sanguíneos encontrados em áreas proporcionais de tecido.

Estes dados serão analisados quantitativamente, utilizando os testes estatísticos: Análise de Variância (ANOVA) e o teste de comparação de médias de Ducan (P < 0,05). Os valores médios dos parâmetros e metabólitos sanguíneos coletados também serão analisados quantitativamente pelos mesmos testes estatísticos.