GOSCH, C, S¹; OLIVEIRA, M, A, P¹; DORTA, M, C¹, L; PEREIRA, L, I, A¹; PEREIRA, A, J, C, S²; RIBEIRO-DIAS, F¹.

INTRODUÇÃO: A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) é uma zoonose causada por protozoários pertencentes ao gênero Leishmania que sobrevivem e se multiplicam em células do sistema fagocítico mononuclear. No Brasil, a LTA vem apresentando um franco crescimento, em magnitude e expansão geográfica, sendo encontrada em praticamente todos os estados, onde a incidência ocorre principalmente em áreas com precárias condições sócio-econômicas e com baixos níveis de infra-estrutura médico-sanitária (GONTIJO & CARVALHO, 2003). As principais espécies responsáveis pela LTA no Brasil pertencem a dois Subgêneros: (1) Viannia, representado por L. (v.) braziliensis e L. (v.) guyanensis causam lesões cutâneas e mucocutâneas e (2) Leishmania, representado por L. (L.) amazonensis, causa lesão cutânea localizada ou a forma difusa. As manifestações clínicas das leishmanioses no homem podem variar desde uma simples lesão cutânea até lesões destrutivas da mucosa, como conseqüência de uma complexa resposta imunológica do hospedeiro, de sua resistência natural e da virulência da espécie envolvida na infecção (GALLIMBERT & KATZ, 1994). Assim, a doença passa a ter um amplo espectro de variação clínica, com prognóstico variável, indo desde formas que evoluem para a cura espontânea até as formas resistentes à terapêutica convencional que podem levar à morte (CARVALHO et al., 1995; COLMENARES et al., 2002). Dessa maneira, a caracterização da espécie responsável pela doença e a associação com os dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais são imprescindíveis para definir o melhor esquema terapêutico para o tratamento e resolução da infecção.

METODOLOGIA: Foram estudados nove pacientes atendidos no Hospital de Doenças Tropicais – Anuar Auad – (HDT), de Goiânia –Goiás, diagnosticados com LTA através de dados clínicos, epidemiológicos e laboratoriais (exame direto, pesquisa de anticorpos por imunofluorescência indireta (IFI), intradermorreação de Montenegro (IRM) e análise histopatológica de cortes de biópsias corados por Hematoxilina-Eosina (HE) e PAS). Os pacientes foram tratados com antimônio pentavalente (glucantime) e acompanhados periodicamente. Fragmentos de biópsias foram macerados e inoculados em pata de camundongos deficientes de interferon gama (IFN-g KO) e após o desenvolvimento da lesão na pata, os parasitos foram isolados e cultivados in vitro em meio de Grace a 26°C e a determinação da espécie foi realizada pela técnica de PCR-RFLP, descrita por VOLPINI et al. (2004), com alterações. Brevemente, para a extração do DNA genômico, os parasitos em fase estacionária, foram lavados com PBS (1800 g, 15 min), ressuspendidos em 150 m L de TELT (50 mM Tris; pH 8.0, 62,5 mM EDTA; pH 9.0, 2,5 M LiCl; 4 % Triton X-100), homogenizados por 5 min. Após foram adicionados 150m L de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico, seguido de centrifugação (15.000 g, 5 min, temperatura ambiente (T.A.). Em seguida, a porção aquosa do sobrenadante foi colhida e foram adicionados 300 m L de etanol absoluto. Após incubação por 20 h (-20ºC), as amostras foram centrifugadas (15.000 g, 5 min, T.A), e lavados com 1 mL de etanol 70%. Ao precipitado foram adicionados 30 m L de RNAse (50 m g/mL em TE, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0) e o mesmo foi incubado por 1 h (37ºC). Na amplificação foi usado 1 m M de cada primer (150: 5’ GGG(G/T)AGGGGCGTTCT(C/G)CGAA 3’ e 152: 5’ (C/G)(C/G)(C/G)(A/T)CTAT(A/T) TTACACCAACCCC 3’), 200 m M de dNTPs (dUTP) 0.8 U de Taq DNA polimerase, tampão (10 mM Tris-HCL pH 8.6; 50 mM KCl; 1.5 mM MgCl₂) e 1 m L do DNA molde. A amplificação foi realizada em termociclador Mastercycler personal (Eppendorf), nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95ºC por 5 min, seguido de 35 ciclos a 95ºC por 1 min, 55ºC por 30 seg e 72ºC por 10 seg e extensão final a 72ºC de 5 min. O produto de amplificação da PCR foi visualizado após eletroforese em gel de poliacrilamida 8%, utilizando Mini-ProteanÒ 3cell (BioRad), revelado pela coloração de nitrato de prata (o gel foi fixado em solução de 0,5% de ácido acético em etanol 10% por 10 min, corado com nitrato de prata 0.2% por 15 min e lavado com água, revelado com 0.3% de formaldeído em NaOH 0,75M). Na restrição (PCR-RFLP) as amostras amplificadas na PCR, foram digeridas pela adição de 1U da enzima Hae III por 3h a 37ºC. A enzima cliva fragmentos de DNA do subgênero Viannia. Os fragmentos da restrição foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 15%, usando Mini-ProteanÒ 3cell (BioRad), e o gel foi corado pela prata, como descrito acima. A diferenciação de L. (V.) braziliensis e L.(V.) guyanensis, ambos do subgênero Vianna, foi realizado conforme CASTILHO et al. (2003).

RESULTADOS E DISCUSSÃO: O exame clínico identificou lesões cutâneas localizadas do tipo ulcerada (cinco pacientes), do tipo úlcero-crostosa (um paciente) e do tipo eritomatosa (um paciente). A forma cutânea disseminada foi identificada em um dos pacientes e a forma cutânea difusa com lesões nodulares, verrugosas e tuberculóides, em outro. O tempo de doença dos pacientes variou entre 45 dias a 14 anos. Os dados epidemiológicos revelaram que a transmissão da leishmania ocorreu em área rural, onde os pacientes residiam ou possuíam atividade profissional ligada à agricultura ou a pecuária. Os pacientes são provenientes da região Centro-Oeste (cinco do estado de Goiás (GO) e dois do estado do Mato Grosso(MT)) e Norte ( um do estado do Tocantins (TO) e um do estado do Pará (PA)). Todos em idade produtiva variando de 20 a 57 anos, sendo cinco homens e três mulheres. Os exames laboratoriais realizados para a confirmação do diagnóstico foram: exame direto, com resultado positivo em sete pacientes; pesquisa de anticorpos no soro (IFI), onde os títulos de anticorpos variaram de 20 a 640; intradermorreação de Montenegro (IRM), apenas 3 pacientes foram positivos, apresentavam forma clínica cutânea localizada (n=2) ou disseminada (n=1); análises histopatológicas, com observação de parasitos ou quadro sugestivo de LTA em todos os pacientes. A PCR-RFLP futilizada para caracterizar as espécies de leishmania dos isolados identificou: Leishmania (L.) amazonensis (L.a, n=4, 2 de GO, 1 do TO, 1 do MT), Leishmania (V.) braziliensis (L.b, n=4, 3 de GO, 1 MT) e Leishmania (V.) guyanensis (L.g,n=1, PA).

CONCLUSÃO: Não houve associação entre os dados clínicos-laboratoriais, a espécie de parasito e a evolução da infecção durante o tratamento. A alta variabilidade dos dados apontam para a necessidade de aumentar o número de pacientes avaliados e de ampliar os estudos sobre a biologia dos parasitos e a resposta imune do hospedeiro.

Carvalho, E.M.; Correia, D.F.; Bacellar O.; Almeida, R.P.; Lessa, H. & Rocha, H. Characterization of the immune response in subjects with self-healing cutaneous leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg. V. 53 p. 273-77. 1995.

CASTILHO, T. M.; SHAW, J. J.; FLOETER-WINTER, L. M. New PCR using glucose 6-phosphate dehydrogenase for identification of Leishmania species. Journal of Clinical Microbiology. V.41, n. 2, p. 540-546. 2003.

COLMENARES, M.; KAR, S.; GOLDSMITH-PESTAN, K. & MACMAHON-PRATT, D. Mechanisms of pathogenesis: differences amongst Leishmania species. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. v. 96, n. I, p. S3-7. 2002.

GALLIMBERTI, R.T.I. & KATZ, G. Leishmaniose Tegumentar Americana. Divisão de doenças transmitidas por vetores/Zoonoses - Centro de Vigilância Epidemiológica - Boletim Epidemiológico. P. 3-5. 1994.

GONTIJO, B. & CARVALHO, M.L.R. Leishmaniose Tegumentar Americana. Rev.Soc.Bras.Med.Trop. v. 36, n. 11, p. 71-80. 2003.

VOLPINI, A. C.; PASSOS, V. M. A.; OLIVEIRA, G. C. & ROMANHA, A. J. PCR-RFLP to identify Leishmania (Viannia) braziliensis and L. (Leishmania) amazonensis causing American cutaneous leishmaniasis. Acta Tropica. V.90, p. 31-37. 2004.

FONTE DE FINANCIAMENTO: CAPES, CNPq.