DETECÇÃO DE ASTROVÍRUS EM AMOSTRAS FECAIS DE CRIANÇAS COM GASTROENTERITE AGUDA PROVENIENTES DAS CIDADES DE GOIÂNIA – GOIÁS E BRASÍLIA – DISTRITO FEDERAL.

SANTOS, R. A. T.¹; SILVA, P. A.¹; BORGES, A. M. T.¹; TEIXEIRA, J. M. S.²; GIUGLIANO, L. G.³; XIMENES, R. O.¹; SILVA, D. F. V.¹; CARDOSO, D. P. P.¹

(¹Laboratório de Virologia Humana, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública, Universidade Federal de Goiás, Goiânia – Goiás; ²Instituto de Saúde do Distrito Federal, LACEN, Brasília – Distrito Federal; ³Laboratório de Microbiologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Brasília, Brasília – Distrito Federal).

E-mail: rat_santos@yahoo.com.br

Palavras-chave: Astrovírus, RT-PCR, Cultivo Celular

INTRODUÇÃO

Os astrovírus humanos, família Astroviridae, são reconhecidos como um dos agentes virais causadores de gastroenterite em crianças. São vírus não envelopados com aproximadamente 28 nm de diâmetro e possuem uma fita simples de RNA (ssRNA) de polaridade positiva com 6.8 a 7.6 Kb. O genoma contém três regiões de leitura aberta (ORFs) designadas ORF-1a e ORF-1b, que codificam proteínas não-estruturais incluindo a polimerase viral, e a ORF-2 que codifica proteínas estruturais que compõem o capsídeo viral. Diferentes metodologias têm sido utilizadas para a detecção de astrovírus, sendo que a RT-PCR com iniciadores desenhados para a região do capsídeo viral, é atualmente empregada em larga escala para a detecção destes agentes (Lewis et al., 1994; Medina et al., 2000; Matsui;Greenberg, 2001; Cardoso et al., 2002).

OBJETIVOS

O presente estudo teve como objetivos a detecção de astrovírus pela RT-PCR em espécimes fecais de crianças com gastroenterite aguda provenientes das cidades de Goiânia-GO e Brasília-DF, além do cultivo de amostras para astrovírus em células Caco-2.

MATERIAL E MÉTODOS

Material de estudo – Consistiu de amostras fecais coletadas de crianças menores de 5 anos de idade que apresentavam quadro de gastroenterite aguda. Um total de 1244 amostras fecais foi obtido entre outubro de 1994 a janeiro de 1996 e março de 1998 a agosto de 2002.

Metodologia – O ssRNA viral foi extraído a partir das suspensões fecais a 20%, seguindo a metodologia descrita por Boom et al., (1990) com modificações. A seguir, o DNA complementar (cDNA) foi obtido a partir de um volume de 16 mL de RNA, acrescido de 2 mL do iniciador randômico pd(N)₆ (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.). Posteriormente, foi utilizada para amplificação 10 mL do cDNA utilizando o par de iniciadores específicos Mon 269 e Mon 270 desenhados para a região ORF-2 resultando num amplicon de 449 pb, conforme descrito por Noel et al., (1995).

No procedimento de cultivo, as suspensões fecais a 20% foram tratadas, previamente, com antibióticos e antifúngico, utilizando o método de Brinker et al., (2000) com modificações, utilizando a linhagem celular Caco-2 (adenocarcinoma de cólon humano).

RESULTADOS

Tabela 01. Percentagem de amostras positivas para astrovírus de acordo com a cidade de coleta.

Local	N^o	%
Goiânia	21/743	2,8
Brasília	25/501	5,0
Total	46/1244	3,7

Tabela 02. Percentagem de amostras positivas para astrovírus provenientes de crianças das cidades de Goiânia-GO e Brasília-DF de acordo com a faixa etária.*

Faixa etária (meses)	N^o	%
< 6	11/305	3,6
7-12	14/426	3,3
13-24	6/295	2,0
25-36	3/102	2,9
> 36	6/92	6,5
Total	40/1220	3,3

*24 amostras sem informação a respeito da idade, sendo 6 delas positivas para astrovírus.

Tabela 03. Percentagem de amostras positivas para astrovírus provenientes de crianças das cidades de Goiânia-GO e Brasília-DF em relação aos meses do ano.*

Meses	N^o	%
Setembro – Março	44/779	5,6
Abril – Agosto	2/464	0,4
Total	46/1243	3,7

c² = 20.77 p<0,001

*1 amostra sem informação a respeito da data de coleta, sendo esta negativa para astrovírus.

Tabela 04. Associação entre astrovírus e outros agentes virais causadores de gastroenterite.

Associação	N^o
Astrovírus / Rotavírus	6
Astrovírus / Calicivírus	6
Astrovírus / Adenovírus	1
Astrovírus / Calicivírus / Rotavírus	1
Total	14

O cultivo de astrovírus foi realizado para 20 amostras, sendo que em 11 delas foi observado (após a primeira passagem em células Caco-2) efeito citopático visível e característico para o agente viral em estudo. Em 4 dessas amostras foi observada por RT-PCR positividade para o agente.

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

· Neste estudo, o índice de detecção para astrovírus foi de 3,7%, o que está de acordo com dados da literatura (Mustafá et al., 2000; Medina et al., 2000; Cardoso et al., 2002). Foi observada diferença no índice de detecção de astrovírus nas duas cidades onde o estudo foi realizado, sendo que em Brasília-DF foi detectado o maior índice (5,0%).

· Foi observada a presença do agente em todas as faixas etárias estudadas entre 40 amostras positivas.

· Em relação aos meses do ano, foi observado maior índice de positividade para astrovírus entre os meses de setembro a março (p<0,001), que correspondem à estação chuvosa em Goiânia-GO e Brasília-DF, contrastando-se com a ocorrência de rotavírus nessas cidades que é maior nos meses correspondentes ao período de baixa umidade (Cardoso et al., 2003).

· Em 14 (30,4%) amostras foi observada infecção dupla ou tripla com outros agentes virais, dificultando afirmar qual o agente causal da infecção. Estudo realizado por Róman et al., (2003) também relata percentual de co-infecção viral semelhante entre astrovírus e rotavírus.

· Dados deste estudo confirmam dados previamente reportados em Goiânia e reforça a circulação de astrovírus como agente de gastroenterite aguda em crianças das cidades de Goiânia-GO e Brasília-DF.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. BOOM, R, et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol, v. 28, p. 495-503, 1990.

2. BRINKER, J.P.; BLACKLOW, N.R.; HERRMANN, J.E. Human astrovirus isolation and propagation in multiple cell lines. Arch Virol, v. 145, p. 1847-1856, 2000.

3. CARDOSO, D.P.P, et al. Detection and genotyping of astroviruses from children with acute gastroenteritis from Goiânia, Goiás, Brazil. Med Sci Monit, v.8, p. 624-628, 2002.

4. CARDOSO, D.P.P, et al. Epidemiological features of rotavirus infection in Goiânia, Goiás, Brazil, from 1986 to 2000. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 98, p. 25-29, 2003.

5. LEWIS, T.L, et al. Analysis of astrovirus serotype 1 RNA, identification of the viral RNA-dependent RNA polymerase motif, and expression of a viral structural protein. J Virol, v. 68, p. 77-83, 1994.

6. MATSUI, S.M.; GREENBERG, H.B. Astrovirus. In: KNIPE, D.M; HOWLEY P.M.; GRIFFIN, D.E.; MARTIN, M.A.; LAMB, R.A.;ROIZAMAN, B. Fields Virology, 4ed., Philadelphia: Lippincott-Raven Press, v.1, cap. 28, p. 875-893, 2001.

7. MEDINA, S.M, et al. Identification and type distribution of astrovirus among children with gastroenteritis in Colombia and Venezuela. J Clin Microbiol, v. 38, p. 3481-3483, 2000.

8. MUSTAFÁ, H.; PALOMBO, E.A.; BISHOP, R.F. Epidemiology of astrovirus infection in young children hospitalized with acute gastroenteritis in Melbourne, Australia, over a period of four consecutive years, 1995 to 1998. J Clin Microbiol, v. 38, p. 1058-1062, 2000.

9. NOEL, J.S, et al. Typing of human astrovirus from clinical isolates by enzyme immunoassay and nucleotide sequencing. J Clin Microbiol, v. 33, p. 797-801, 1995.

9. RÓMAN, E, et al. Acute viral gastroenteritis: proportion and clinical relevance of multiple infections in Spanish children. J Med Virol, v. 52, p. 435-440, 2003.

Órgãos de Fomento: CAPES, CNPq