Grisi, M.C.M.; Brondani,C.; Brondani, R.P.V

O feijão (Phaseolus vulgaris L.) é uma cultura amplamente difundida no Brasil, refletindo na sua posição de maior produtor e consumidor mundial. A produtividade média nacional de feijão tem permanecido em torno de 600 kg/ha, embora o potencial da cultura, sob condições ótimas de manejo, atinja até 5.000 kg/ha. Para contornar este problema necessita-se aprimorar as técnicas de melhoramento.

Os mapas de ligação favorecem a identificação, com precisão, de regiões genômicas de interesse agronômico. O desenvolvimento destes mapas em um espaço de tempo relativamente curto e compostos por um grande número de marcadores moleculares tem sido possibilitado graças aos avanços ocorridos na área de genética genômica e ao desenvolvimento de programas computacionais e estatísticos que auxiliam na interpretação dos dados gerados.

Dentre as classes de marcadores moleculares, destacam-se os microssatélites (SSR – Simple Sequence Repeat), devido a sua ampla dispersão no genoma, codominância, multialelismo e a possível transferibilidade para espécies próximas taxonomicamente. Essas características tornam tais marcadores valiosos para o mapeamento genético e caracterização molecular das espécie.

Este projeto propõe-se a mapear um conjunto de marcadores SSR no mapa internacional da cultura do feijão, previamente construído com base em marcadores RAPD e RFLP, visando integrar os mapas genéticos dos parentais e disponibilizar um mapa consenso para feijão.

O material vegetal que será utilizado está disponibilizado para a equipe de pesquisadores da Embrapa Arroz e Feijão, através da parceria com o Dr. Paul Gepts, da Universidade da Califórnia (Davis). Esse material consiste em 75 linhagens híbridas recombinantes, obtidas do cruzamento BAT93 x Jalo EEP558.

As extrações de DNA foram realizadas segundo o protocolo descrito por Brondani et al. (1998). A concentração do DNA foi estimada por eletroforese em gel de agarose 1,0%, por comparação com o DNA-padrão do fago l de peso molecular conhecido. A concentração de cada amostra de DNA será ajustada para 3 ng/m l.

Para a análise genética serão utilizados um conjunto de 99 marcadores microssatélites previamente desenvolvidos, caracterizados e disponibilizados na literatura (Buso et al., 1999; Yu et al., 1999; Gaitán-Solís et al., 2002).

Inicialmente, os 99 marcadores foram testados à temperatura de 56^oC. Os primers que não amplificaram foram submetidos a novos testes com temperaturas mais baixas (48^oC, 50^oC e 52^oC). Em alguns casos foi necessário aumentar a temperatura (58^oC e 60^oC) para melhorar a especificidade do produto amplificado.

As reações de amplificação foram conduzidas em placas de 96 poços, com volume final de 15 m l. A checagem da amplificação foi feita por eletroforese horizontal em gel de agarose 3% contendo 0,2 m g/ml de brometo de etídio.

Os marcadores que apresentarem polimorfismo para os parentais serão submetidos à eletroforese em géis de acrilamida 6% coradas com nitrato de prata para genotipagem da população segregante.

Os mapas de ligação serão obtidos com o programa Mapmaker versão 2.0 (Lander et al., 1987) para Macintosh, com os parâmetros de LOD score=5.0, máxima fração de recombinação de 0.25 e função de mapeamento de Kosambi.

O mapa consenso de feijão, construído na população das 75 linhagens endogâmicas RIL BAT93 x Jalo EEP558, possui 120 marcadores RFLP e 430 marcadores RAPD, totalizando uma distância de mapa de 1226 cM (Freyre et al., 1998). As 75 RIL e os dados de segregação dos marcadores RAPD e RFLP serão utilizados para integrar, no mapa consenso de feijão, os marcadores microssatélites cujo polimorfismo entre os parentais for detectado.

Os 99 marcadores microssatélites foram testados para o ajuste da temperatura de anelamento. Desses, 8 amplificaram à 48^oC; 6 amplificaram à 50^oC, 8 à 52^oC, 60 à 56^oC, 6 à 58^oC e 1 à 60^oC. Apenas 5 primers não amplificaram e 5 devem ainda ser testados à temperaturas mais baixas (48^oC ou 50^oC).

Figura 1. Resultado do teste de amplificação de 24 marcadores microssatélites para temperatura de anelamento de 56^oC.

Os primers, cujas as temperaturas de anelamento foram ajustadas, serão avaliados quanto ao polimorfismo em um conjunto de seis indivíduos, sendo dois deles os parentais BAT 93 e Jalo EEP558, e quatro uma amostra da população segregante RIL obtida do cruzamento entre estas duas cultivares.

Dos 99 locos testados, 89 amplificaram de forma satisfatória e serão avaliados quanto ao nível de polimorfismo entre os parentais Bat x Jalo;

Os locos que apresentarem polimorfismo, em pelo menos um parental, serão utilizados na análise de segregação;

A disponibilização de um mapa genético desenvolvido com base em marcadores SSRs, polimórficos entre os dois parentais possibilitará a integração dos mapas e a avaliação do grau de conservação da ordem e ligação entre os mapas;

A consolidação dos dados de segregação dos marcadores SSR dos dois parentais possibilitará obtenção de um mapa integrado para a cultura do feijoeiro e permitirá a troca de informações entre laboratórios, principalmente quando forem associados dados fenotípicos a estes marcadores, através da análise de QTLs

BRONDANI, R.P.V; BRONDANI, C.; TARCHINI, R.; GRATTAPAGLIA, D. Development, characterization and mapping of microsatellite markers in Eucalyptus grandis and E. urophylla. Theoretical Applied Genetics, v. 97, p 816-827, 1998

BUSO, G.S.C.; AMARAL, Z.P.; BRONDANI, R.P.V.; REIS, A.M.M.; MORETZSOHN, M.C. & FERREIRA, M. E. In: Anais do Simpósio de Recursos Genéticos da América Latina e Caribe (Sirgealc). Embrapa, Brasília, 1999.

GAITÁN-SOLÍS, E.; DUQUE, M.C.; EDWARDS, K.J.; TOHME, J. Microsatellite repeats in common bean (Phaseolus vulgaris): Isolation, characterization and cross-species amplification in Phaseolus ssp. Crop Science, v. 42, p. 1228-1236, 2002.

LANDER, E.S.; GREEN, P.; ABRAHAMSON, J.; BAARLOW, A.; DALY, M.J.; LINCOLN, S.E. et al. Mapmaker: an interactive computer pakage for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics, v. 1, p.174-181. 1987.

YU, K.; PARK, S.J.; POYSA, V.; GEPTS, P. Integration of simple sequence repeat (SSR) markers into a molecular linkage map of common bean (Phaseolus vulgaris L.). The Journal of Heredity, v. 91, p. 429-434, 2000.

FREYRE, R.; SKROCH, P.W.; GEFFROY, V.; ADAM-BLONDON, A.F.; SHIRMOHAMADALI, A.; JOHNSON, W. C.; LLACA, V.; NODARI, R.O.; PEREIRA P.A.; TSAI S.M.; TOHME J.; DRON M.; NIENHUIS J.; VALLEJOS C.E.; GEPTS P. Towards an integrated linkage map of common bean . 4. Development of a core linkage map and alignment of RFLP maps. Theoretical Applied Genetics, v. 97, p. 847-856, 1998.

CNPq/Universal 2003; CAPES/Bolsa mestrado MCG.