Projeto de dissertação de mestrado: Incorporação de marcadores moleculares microssatélites no mapa internacional da cultura do feijão comum (Phaseolus vulgaris L.), estabelecido com base na população BAT93 x Jalo EEP558
Grisi, M.C.M.; Brondani,C.; Brondani, R.P.V
Embrapa Arroz e Feijão, C. Postal 179, CEP 75375-000, Santo Antônio de Goiás – Go - mattosgrisi@yahoo.com; rosanavb@cnpaf.embrapa.br
PALAVRAS-CHAVES: Phaseolus vulgaris L., mapeamento, microssatélites.
INTRODUÇÃO
O feijão (Phaseolus vulgaris L.) é uma cultura amplamente difundida no Brasil, refletindo na sua posição de maior produtor e consumidor mundial. A produtividade média nacional de feijão tem permanecido em torno de 600 kg/ha, embora o potencial da cultura, sob condições ótimas de manejo, atinja até 5.000 kg/ha. Para contornar este problema necessita-se aprimorar as técnicas de melhoramento.
Os mapas de ligação favorecem a identificação, com precisão, de regiões genômicas de interesse agronômico. O desenvolvimento destes mapas em um espaço de tempo relativamente curto e compostos por um grande número de marcadores moleculares tem sido possibilitado graças aos avanços ocorridos na área de genética genômica e ao desenvolvimento de programas computacionais e estatísticos que auxiliam na interpretação dos dados gerados.
Dentre as classes de marcadores moleculares, destacam-se os microssatélites (SSR – Simple Sequence Repeat), devido a sua ampla dispersão no genoma, codominância, multialelismo e a possível transferibilidade para espécies próximas taxonomicamente. Essas características tornam tais marcadores valiosos para o mapeamento genético e caracterização molecular das espécie.
Este projeto propõe-se a mapear um conjunto de marcadores SSR no mapa internacional da cultura do feijão, previamente construído com base em marcadores RAPD e RFLP, visando integrar os mapas genéticos dos parentais e disponibilizar um mapa consenso para feijão.
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal
O material vegetal que será utilizado está disponibilizado para a equipe de pesquisadores da Embrapa Arroz e Feijão, através da parceria com o Dr. Paul Gepts, da Universidade da Califórnia (Davis). Esse material consiste em 75 linhagens híbridas recombinantes, obtidas do cruzamento BAT93 x Jalo EEP558.
As extrações de DNA foram realizadas segundo o protocolo descrito por Brondani et al. (1998). A concentração do DNA foi estimada por eletroforese em gel de agarose 1,0%, por comparação com o DNA-padrão do fago l de peso molecular conhecido. A concentração de cada amostra de DNA será ajustada para 3 ng/m l.
Teste e ajuste das condições de amplificação dos locos SSRs
Para a análise genética serão utilizados um conjunto de 99 marcadores microssatélites previamente desenvolvidos, caracterizados e disponibilizados na literatura (Buso et al., 1999; Yu et al., 1999; Gaitán-Solís et al., 2002).
Inicialmente, os 99 marcadores foram testados à temperatura de 56oC. Os primers que não amplificaram foram submetidos a novos testes com temperaturas mais baixas (48oC, 50oC e 52oC). Em alguns casos foi necessário aumentar a temperatura (58oC e 60oC) para melhorar a especificidade do produto amplificado.
As reações de amplificação foram conduzidas em placas de 96 poços, com volume final de 15 m l. A checagem da amplificação foi feita por eletroforese horizontal em gel de agarose 3% contendo 0,2 m g/ml de brometo de etídio.
Os marcadores que apresentarem polimorfismo para os parentais serão submetidos à eletroforese em géis de acrilamida 6% coradas com nitrato de prata para genotipagem da população segregante.
Análise de dados
Os mapas de ligação serão obtidos com o programa Mapmaker versão 2.0 (Lander et al., 1987) para Macintosh, com os parâmetros de LOD score=5.0, máxima fração de recombinação de 0.25 e função de mapeamento de Kosambi.
O mapa consenso de feijão, construído na população das 75 linhagens endogâmicas RIL BAT93 x Jalo EEP558, possui 120 marcadores RFLP e 430 marcadores RAPD, totalizando uma distância de mapa de 1226 cM (Freyre et al., 1998). As 75 RIL e os dados de segregação dos marcadores RAPD e RFLP serão utilizados para integrar, no mapa consenso de feijão, os marcadores microssatélites cujo polimorfismo entre os parentais for detectado.
Resultados Parciais
Os 99 marcadores microssatélites foram testados para o ajuste da temperatura de anelamento. Desses, 8 amplificaram à 48oC; 6 amplificaram à 50oC, 8 à 52oC, 60 à 56oC, 6 à 58oC e 1 à 60oC. Apenas 5 primers não amplificaram e 5 devem ainda ser testados à temperaturas mais baixas (48oC ou 50oC).
Figura 1. Resultado do teste de amplificação de 24 marcadores microssatélites para temperatura de anelamento de 56oC.
Os primers, cujas as temperaturas de anelamento foram ajustadas, serão avaliados quanto ao polimorfismo em um conjunto de seis indivíduos, sendo dois deles os parentais BAT 93 e Jalo EEP558, e quatro uma amostra da população segregante RIL obtida do cruzamento entre estas duas cultivares.
CONCLUSÕES
Dos 99 locos testados, 89 amplificaram de forma satisfatória e serão avaliados quanto ao nível de polimorfismo entre os parentais Bat x Jalo;
Os locos que apresentarem polimorfismo, em pelo menos um parental, serão utilizados na análise de segregação;
A disponibilização de um mapa genético desenvolvido com base em marcadores SSRs, polimórficos entre os dois parentais possibilitará a integração dos mapas e a avaliação do grau de conservação da ordem e ligação entre os mapas;
A consolidação dos dados de segregação dos marcadores SSR dos dois parentais possibilitará obtenção de um mapa integrado para a cultura do feijoeiro e permitirá a troca de informações entre laboratórios, principalmente quando forem associados dados fenotípicos a estes marcadores, através da análise de QTLs
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BRONDANI, R.P.V; BRONDANI, C.; TARCHINI, R.; GRATTAPAGLIA, D. Development, characterization and mapping of microsatellite markers in Eucalyptus grandis and E. urophylla. Theoretical Applied Genetics, v. 97, p 816-827, 1998
BUSO, G.S.C.; AMARAL, Z.P.; BRONDANI, R.P.V.; REIS, A.M.M.; MORETZSOHN, M.C. & FERREIRA, M. E. In: Anais do Simpósio de Recursos Genéticos da América Latina e Caribe (Sirgealc). Embrapa, Brasília, 1999.
GAITÁN-SOLÍS, E.; DUQUE, M.C.; EDWARDS, K.J.; TOHME, J. Microsatellite repeats in common bean (Phaseolus vulgaris): Isolation, characterization and cross-species amplification in Phaseolus ssp. Crop Science, v. 42, p. 1228-1236, 2002.
LANDER, E.S.; GREEN, P.; ABRAHAMSON, J.; BAARLOW, A.; DALY, M.J.; LINCOLN, S.E. et al. Mapmaker: an interactive computer pakage for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations. Genomics, v. 1, p.174-181. 1987.
YU, K.; PARK, S.J.; POYSA, V.; GEPTS, P. Integration of simple sequence repeat (SSR) markers into a molecular linkage map of common bean (Phaseolus vulgaris L.). The Journal of Heredity, v. 91, p. 429-434, 2000.
FREYRE, R.; SKROCH, P.W.; GEFFROY, V.; ADAM-BLONDON, A.F.; SHIRMOHAMADALI, A.; JOHNSON, W. C.; LLACA, V.; NODARI, R.O.; PEREIRA P.A.; TSAI S.M.; TOHME J.; DRON M.; NIENHUIS J.; VALLEJOS C.E.; GEPTS P. Towards an integrated linkage map of common bean . 4. Development of a core linkage map and alignment of RFLP maps. Theoretical Applied Genetics, v. 97, p. 847-856, 1998.
FONTE DE FINANCIAMENTO
CNPq/Universal 2003; CAPES/Bolsa mestrado MCG.