Título: Identificação das células produtoras de IL-12 em linfonodos drenantes do sítio de infecção por Leishmania major

CARDOSO, L.P.V.; OLIVEIRA M.A.P.

Laboratório de Imunidade Celular/Setor de Imunologia/IPTSP/UFG

Departamento de Microbiologia, Imunologia, Parasitologia e Patologia

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

Universidade Federal de Goiás

E-mail: ludimilacardoso@yahoo.com.br , mapoliv@iptsp.ufg.br

Palavras-chave: IL-12, Leishmania major, macrófagos.

INTRODUÇÃO: A Leishmaniose Tegumentar é uma doença infecciosa, causada por protozoários do gênero Leishmania, que acomete pele e mucosas (FUNASA, 2000). Modelos murinos de infecção com Leishmania major tem sido usado para caracterizar suscetibilidade e resistência na doença. Alguns camundongos, como C57BL/6, controlam a infecção e se curam espontaneamente, enquanto outros, como BALB/c, falham no controle da infecção e desenvolvem lesão progressiva e doença sistêmica (SACKS & TRAUTH, 2002). A predisposição para a suscetibilidade ou a resistência a infecção com L. major em camundongos está relacionada com a produção dominante de interleucina 4 (IL-4) que, polariza para uma resposta Th2 agravando a doença. A produção de interferon γ (IFN-γ) polariza a resposta para Th1, promovendo a cura da lesão e a eliminação dos parasitos (SACKS & TRAUTH, 2002). A IL-12 é até agora a citocina mais potente conhecida capaz de induzir a produção de IFN-γ por uma variedade de células. Essa citocina é produzida principalmente por monócitos, macrófagos, neutrófilos, células B e células dendríticas, geração de células T auxiliares tipo 1 ( LTh1) in vitro e in vivo , geração de células T citotóxicas, supressão da produção de IgG1 e IgE, indução de auto-imunidade órgão-específica e resistência a infecções bacterianas e parasitárias bem como tumores (TRINCHIERI, 1998; FAQUIM-MAURO, 1999). Na leishmaniose, esta citocina é requerida durante toda a infecção com L. major para manutenção da resposta imune protetora (PARK et al., 2000). Células retiradas dos linfonodos drenantes do sítio de infecção de camundongos de diferentes linhagens produzem IL-12 após infecção com formas promastigotas de L. major em quantidades semelhantes àquelas estimuladas por T. cruzi e T. gondii (OLIVEIRA et al., 2000). Como estes dois últimos parasitos, ao contrário das leishmanias, são potentes indutores da produção de IL-12 por macrófagos in vitro, algumas células presentes nos linfonodos infectados, que não macrófagos, devem participar da produção de IL-12 in vivo após a infecção por Leishmania. Como recentemente foi demonstrado que células mielóides imaturas são mais facilmente induzidas a produzirem IL-12 in vitro após o estímulo com LPS (OLIVEIRA et al., 2003) ou com formas promastigotas de Leishmania (OLIVEIRA, submetido) está sendo avaliada neste projeto a participação destas células imaturas na produção de IL-12 in vivo.

OBJETIVO: Avaliar a produção de IL-12p40 e IL-12p70 por células totais ou subpopulações celulares obtidas de linfonodos de diferentes linhagens de camundongos infectados com leishmania de referência ou isolados da região Centro Oeste.

METODOLOGIA: Até o momento, foi utilizado o clone de L. major (MHOM/IL/80/Friedlin), do qual obtivemos as formas promastigotas de fase estacionária colhidas entre cinco e seis dias. Os camundongos (fêmeas BALB/c com 6 a 10 semanas de idade) foram infectados em cada pata com 2x106 e 5x106 promastigotas em PBS. Depois de 48 horas de infecção, os linfonodos poplíteos (linfonodos que drenam o sítio da infecção) foram removidos assepticamente e triturados em placas de petri. Os linfonodos axilares, inguinais e poplíteos dos animais não infectados foram utilizados como controles. Para remoção de células mais imaturas foi utilizado o anticorpo anti-CD31 (clone ER-MP12). As células nos estágios subseqüentes de maturação foram removidas utilizando respectivamente os anticorpos anti-Ly-6C (Clone ER-MP20), anti-HR3 (Clone ER-HR3) e anti-MAC1 (Clone M1/70). Depois de 30 minutos de incubação, as células foram lavadas com RPMI 1640 e incubadas sob agitação com esferas magnéticas conjugadas a anti-imunoglobulina de rato. Depois de 20 a 30 min de incubação, as esferas magnéticas foram removidas pela incubação do tubo por 15 min em presença de um imã. As células colhidas foram cultivadas na concentração de 2x106, 5x106 e 107 células/mL em meio de cultura RPMI 1640 completo (10% de SFB) em placas de 96 poços em estufa a 37ºC contendo 5% de CO2. Depois de 48 h de incubação os sobrenadantes das culturas foram colhidos para dosagem dos níveis de IL-12p40 pelo método de captura por ELISA. Os dados foram comparados quanto à significância dos mesmos pelo Teste de Student’s ou pelo método de análise não paramétrica de Kruskal-Wallis quando aplicável, sendo estabelecida significância quando p<0.05.

RESULTADOS: Utilizando células de linfonodos de camundongos infectados com 2x106 e 5x106 parasitos/pata, a produção de IL-12p40 foi respectivamente de 0.48 e 0.92 ng/ml. A produção de IL-12p40 na cultura de células de linfonodos em uma concentração de 2x106, 5x106 e 107 células/ml em cultura foi respectivamente de 0.209, 0.280 e 0.323 ng/ml. Combinando a infecção com 5x106 parasitos/pata e cultura com 107 células/ml de linfonodos obtivemos 1.149 ng/ml de IL-12p40 no animal infectado e 0.4967 ng/ml no animal não infectado. Com uma produção de 1.149 ng/ml de IL-12p40 no animal infectado, obtivemos as respectivas quedas nas produções de IL-12p40 após remoção das células de acordo com seus marcadores de superfície, células MP12 negativas: 0.7385, MP20 negativas: 0.5740, HR3 negativas: 0.7594 e M170 negativas: 0.6620(ng/ml).

CONCLUSÃO: A melhor dose de infecção foi de 5x106 e a melhor concentração de células/ml em cultura para detecção de IL-12p40 foi de 107. Como ainda existe uma ampla discussão sobre a capacidade das leishmanias induzirem a produção de IL-12, nossos resultados confirmam que formas infectantes de L. major são capazes de estimular a produção de IL-12p40 48 h após a infecção de camundongos BALB/c. Entretanto, não foi possível identificar um marcador de superfície celular que fosse essencial para a produção de IL-12 in vivo, já que a depleção individual de cada subpopulação celular provocou sempre uma queda semelhante na produção de IL-12. Nos próximos experimentos será utilizada uma variação na quantidade de anticorpos utilizados na depleção, bem como na quantidade de esferas magnéticas para tentarmos definir as melhores concentrações para as depleções.

BIBLIOGRAFIA:

FUNASA. Manual de Controle da Leishmaniose Tegumentar Americana: 1-63,2000.

SACKS, D.; TRAUTH, N. N. The immunology of susceptibility and resistance to Leishmania major in mice. Nature. 2: 845-858, 2002.

TRINCHIERI, G. Interleukin-12: a cytokine at the interface of inflamation and immunity. Adv. Immunol 70: 83-243, 1998.

FAQUIM-MAURO, E.; COFFMAN, R. L.; ABRAHAMSOHN, I. A. Cutting edge: mouse IgG1 Antibodies comprise two functionally distinct types that are differentially regulated by IL-4 and IL-12. J. Immun. 3572 - 3576, 1999.

PARK, A.Y.; HONDOWICZ, B. D.; SCOTT, P. IL-12 is required to maintain a Th1 response during Leishmania major infection. J. Immun. 165: 896-902, 2000.

OLIVEIRA, M.A.P.; SANTIAGO, H.C.; LISBOA, R.L.; CERAVOLLO, I.P.; TRINCHIERI, G.; GAZZINELLI, R.T; VIEIRA, L.Q. Leishmania, sp: Comparative study with Toxoplasma gondii and Tripanossoma cruzi in their ability to initialize IL-12 and IFN-γ synthesis. Exp. Parasitology. 95: 96-105, 2000.

OLIVEIRA, M.A.P.; LIMA, G.M.C..A.; SHIO, P. J. M.; LEENEN, P.J.M.; ABRAHAMSOHN, I. A. Immature macrophages derived from mouse bone marrow produce large amounts of IL-12p40 after LPS stimulation. J. Leuk. Biol. 74:857-867, 2003.

 

FONTE DE FINANCIAMENTO: CAPES – Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior.