ANÁLISE METABÓLICA DE Leishmania spp ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA LÍQUIDA (HPLC)
Mendes, J.M*.; Aguiar, A.A.; Vinaud, M.C.;Oliveira, M.A.P., Bezerra, J.C. B.
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA - UFG
e-mail do apresentador: josymariano@hotmail.com
e-mail do orientador: clecildo@iptsp.ufg.br
Palavras-Chave: ácido orgânico, Leishmania, HPLC
Introdução
As leishmanioses constituem um complexo de enfermidades que atingem o homem, causadas por diferentes espécies morfologicamente semelhantes, sendo diferenciadas apenas por métodos bioquímicos, imunológicos ou mesmo patológicos. São doenças do sistema fagocítico mononuclear, causadas por protozoários de diversas espécies pertencentes ao gênero Leishmania, ordem Kinetoplastida (Lainson & Shaw,1987).
Recentemente tem ocorrido um aumento significativo nos casos de leishmanioses em áreas peri-urbanas de grandes cidades, particularmente no Brasil (FIOCRUZ, 1997). Estima-se que 400.000 novos casos ocorram anualmente nas regiões tropicais e subtropicais do globo, estando mais de 10 milhões de indivíduos contaminados e 350 milhões sob risco de infecção. (ANVISA, 2003; WHO, 2003). Esses alarmantes números retratam um alto índice de mortalidade e morbidade das leishmanioses.
Os protozoários pertencentes ao gênero Leishmania são transmitidos ao homem por fêmeas de insetos flebotomíneos do gênero Lutzomyia (Novo Mundo) e Phlebotomus (Velho Mundo), (Genaro, 2000). Durante o ciclo evolutivo, estes protozoários apresentam duas formas básicas: as amastigotas e as promastigotas. As promastigotas vivem no lumem do tubo digestivo do inseto vetor, enquanto as amastigotas infectam células do sistema mononuclear fagocítico do hospedeiro vertebrado (Chang, 1990). Uma vez inoculada na pele do hospedeiro, através da picada do mosquito, a forma promastigota é fagocitada pelos macrófagos se diferenciando em amastigota. Quando a célula hospedeira está densamente parasitada, há o rompimento de sua membrana e as amastigotas disseminam pelos tecidos, infectando novos macrófagos, exarcebando assim, o quadro de infecção (Russeal, 1995).
Características indesejáveis, associadas ao aparecimento de formas resistentes de Leishmania (Geary et al., 1989), têm exacerbado a necessidade do desenvolvimento de drogas antileishmanióticas mais eficazes e menos tóxicas ao paciente. A abordagem moderna de desenvolvimento racional de drogas se baseia na identificação de vias metabólicas indispensáveis à sobrevivência do parasito. Após seleção dos alvos biológicos, o objetivo passa a ser a caracterização detalhada dos componentes da via enzimática envolvida. Enzimas chave podem ser exploradas para o desenvolvimento de inibidores da reação enzimática, sem afetar o hospedeiro.
Baseado na necessidade de conhecer melhor a atividade metabólica do parasito, testes de análises dos ácidos orgânicos excretados e presentes em culturas de formas promastigotas de Leishmania spp foram viabilizados através do método de cromatografia líquida (HPLC), com coluna específica para análise de ácidos orgânicos visando o monitoramento do perfil metabólico, bem como futuros alvos terapêuticos.
Objetivos
Avaliação dos produtos finais de Leishmania spp sob as condições ecofisiológicas de aerobiose e anaerobiose correlacionados com diferentes períodos de crescimento in vitro de Leishmania spp e utilização do método de cromatografia líquida (HPLC) para o monitoramento do perfil metabólico.
Materiais e Métodos
As amostras de formas promastigotas de Leishmania spp foram mantidas em laboratório, através de cultivo in vitro e foram cultivadas em placas de plástico de 75 cm2 (BECTON-DICKINSON) em meio de cultura Grace’s Insect Medium (SIGMA Chemical Co.), suplementado com 20% de soro bovino fetal inativado, 2 mM de l-glutamina, 100 U/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina (Sartori, 1997). Os parasitos de fase logarítmica e de fase estacionária foram colhidos no segundo e quinto dia após o início da cultura, respectivamente.
Foram coletadas amostra na fase logarítmica e na fase estacionária de crescimento de Leishmania spp. Os ácidos orgânicos excretados pelo parasito foram extraídos do meio de cultura por meio de uma coluna de troca aniônica Bond Elut® (Varian), adequada para a separação da fase sólida. Foram analisados dois grupos, um em condição anaeróbia e outro em aeróbia. O terceiro grupo, considerado o controle, foi o meio de cultura sem as formas promastigotas de Leishmania spp. Procedeu-se a análise cromatográfica por meio do equipamento ProStar-Varian com coluna de fase normal Bio-Rad, onde foi injetado 20μL da amostra biológica após extração. A separação dos ácidos orgânicos ocorreu à medida que a amostra foi bombeada através da coluna e são demonstrados por picos e identificados no programa de análise de acordo com o tempo de retenção dos ácidos orgânicos calibrados anteriormente no cromatógrafo.
Resultados e Discussão
Através da análise de ácidos orgânicos pelo HPLC, foi detectado no meio de cultura, sem o parasito, somente fumarato. A amostra de cultura contendo Leishmania spp na fase logarítmica de crescimento do grupo em aerobiose não apresentou separação de nenhum ácido orgânico anteriormente padronizado, no entanto, as outras amostras pertencentes tanto ao grupo em aerobiose quanto em anaerobiose apresentaram picos característicos de succinato e fumarato em concentrações variadas de acordo com a área dos picos apresentados.
A área dos picos obtidos de cada ácido corresponde á sua concentração na amostra. Assim sendo, observou-se que a detecção de fumarato, já presente no meio de cultura , aumenta na fase logarítmica e decai na fase estacionária. O succinato, ausente no meio de cultura, é detectado na fase log de crescimento e na fase estacionária com área de pico decrescente no decorrer do crescimento do parasito. As alterações observadas entre as condições de aerobiose e anaerobiose estão relacionadas com as concentrações dos ácidos no decorrer da curva de crescimento.
O gênero Leishmania, bem como os já estudados membros da família Trypanosomatidae, realizam metabolismo anaeróbio da glicose, tendo como principais produtos finais succinato, acetato, lactato e traços de piruvato (CHATTERJEE, & DATTA, 1974; CANNATA & CAZZULO, 1984). Esta preferência metabólica depende de vários fatores tais como a concentração dos substratos e sua natureza química, pH e aeração do meio de cultura e alterações nas enzimas de células inoculadas (CAZZULO et al 1985).
Conclusão
A análise dos ácidos orgânicos da cultura de Leishmania spp sob as condições ecofisiológicas de aerobiose e anaerobiose correlacionadas com diferentes períodos de crescimento in vitro demonstrou alterações entre as concentrações do fumarato inicialmente presente no meio de cultura e excreção de succinato tanto na fase log quanto na fase estacionária de crescimento. A composição do meio ou tensão de oxigênio no meio no qual os parasitos crescem podem influenciar nas vias bioquímicas, promovendo alterações nas concentrações e detecção dos ácidos orgânicos.
Referências Bibliográficas
*Bolsista da Capes