Avaliação do potencial angiogênico do plasma rico em plaquetas (PRP) e das metodologias para sua quantificação na membrana córioalantóidea do ovo de galinha (Gallus domesticus)

Escola de Veterinária, Universidade Federal de Goiás

Palavras-chave: concentrado de plaquetas, fatores de crescimento, angiogênese, avaliação quantitativa da angiogênese.

A evolução da compreensão sobre a cicatrização de feridas levou à rápida expansão da tecnologia de adesivos teciduais, géis de plaquetas e fatores de crescimento (BRISSET & HOM, 2003). Atualmente subprodutos do sangue têm sido empregados em cirurgias diversas e manejo de feridas de difícil cicatrização, destacando-se o Plasma rico em plaquetas (PRP), obtido do sangue total centrifugado (SEHER et al., 2003).

Os fatores de crescimento tem sido cada vez mais usados no manejo da cicatrização de feridas, sendo reconhecido o uso de plaquetas autólogas e seus produtos como fontes mais econômicas de múltiplos fatores de crescimento (SONNLEITNER et al., 2000).

A angiogênese é um evento importante no desenvolvimento embrionário e em vários eventos fisiológicos, como os processos cicatriciais. É regulada pelo equilíbrio de vários fatores estimulantes e inibidores, dos quais pode-se lançar mão para o tratamento e manejo de pacientes com problemas respectivamente na cicatrização de feridas, ou portadores de doenças dependentes da angiogênese (RIBATTI et al., 1999; MELKONIAN et al., 2002).

Dentre vários modelos propostos para o estudo da angiogênese destaca-se a membrana córioalantóidea do embrião de ave, um modelo de baixo custo, simples e confiável, características importantes na escolha de um método para pesquisa (GOTTRUP, 2001; RIBATTI et al., 2004). Seu uso possibilita a comparação entre dados obtidos em diferentes laboratórios, e assim, avanços no conhecimento acerca de drogas que influenciam na angiogênese bem como de mecanismos moleculares envolvidos. No entanto, a ampla gama de metodologias utilizadas, em especial na quantificação da resposta, dificultam, por vezes até inviabilizam, tais comparações entre dados obtidos por diferentes equipes (RICHARDSON & SINGH, 2003).

1- Obtenção do PRP

O PRP será obtido de sangue de cães doadores, triados através de exames de perfil de coagulação (tempo de tromboplastina parcial ativada e tempo de pró-trombina) e contagem plaquetária.

O sangue será colhido em tubos de ensaio contendo citrato de sódio, e transportados imediatamente para o laboratório, onde serão centrifugados a 1200 rpm por 20 min, resultando na separação do sangue total em duas fases (soro e elementos figurados). Um ponto de 0,8 cm abaixo da divisão de fases será marcado no exterior do tubo, e o conteúdo localizado acima dessa marca será pipetado, transferido para outro tubo e centrifugado durante 15 min. Então estarão visualmente separados o soro e o concentrado de plaquetas, os produtos serão transferidos para recipientes diferentes e reservados para uso (SONNLEITNER et al., 2000).

De cada doador serão obtidas duas concentrações de PRP, através da homogeneização de PRP e uma alíquota de soro, nas proporções de 1:1 e 1:2. Neste momento serão preparadas lâminas para nova contagem plaquetária. A ativação do PRP será feita pela adição de solução de cloreto de cálcio a 10% e trombina (LANDESBERG et al., 2000).

2- Preparação da CAM

Será seguido o método in ovo. Os ovos são acomodados em incubadora sob umidade constante a 37º C. No terceiro dia serão removidos 2 a 3 mL de albumen para separar a CAM da casca e será feita uma janela, que consiste de uma abertura quadrada na casca para a exposição da CAM. A janela será selada com filme plástico e a incubação continuará até o dia de início do experimento, o 15º dia, quando o PRP ativado será colocado sobre a membrana exposta (OH et al., 1997; RIBATTI et al., 2004).

3- Avaliação

Os ovos serão incubados por mais dois dias, quando estarão prontos para avaliação. Os embriões serão sacrificados por hipotermia em água gelada, e os fragmentos de membrana recortados (DANI & ESPINDOLA, 2002).

Serão capturadas imagens da membrana a fresco em microscópio de luz para avaliação posterior. Então os fragmentos serão fixados em solução de Formol 10% por 24 horas, incluídas em parafina e preparadas para coloração. As técnicas de coloração serão definidas durante o experimento piloto, estando entre as opções as colorações Hematoxilina Eosina e azul de Toluidina, e as lâminas serão avaliadas em microscopia de luz (BARNHILL & RYAN, 1983).

As imagens a fresco serão analisadas pelo método semi-quantitativo no qual dois observadores atribuem escores de zero a quatro a seis campos escolhidos aleatoriamente nas lâminas, onde zero significa ausência de angiogênese e quatro significa máxima angiogênese. (MILLER et al., 2004). Então, as mesmas imagens serão submetidas à análise por softwares desenvolvidos para morfometria histológica (AxioVision e NIH), para avaliação quantitativa (MELKONIAN et al., 2002).

Outro modo de avaliação empregado consistirá da quantificação da densidade vascular pelo número total de vasos transversalmente seccionados contados nos pontos de intersecção de um papel reticulado de 12 linhas x 12 linhas em seis campos aleatórios, procedimento repetido por dois observadores e cujos resultados serão processados estatisticamente (EHRBAR et al., 2004). O número de campos aleatórios contados será confirmado pelo estudo piloto através de média acumulada, podendo diferir dos seis campos citados por outros autores.

Os dados serão processados estatisticamente através de testes para variáveis paramétricas (t de Student) e não paramétricas (Mann-Whitney U), de acordo com os resultados obtidos (MILLER et al., 2004).

Os resultados dos estudos fornecerão informações sobre o potencial angiogênico do PRP, corroborando, ou não, com a literatura que lhe atribui grande valor como coadjuvante em procedimentos cirúrgicos ou no manejo da cicatrização de feridas. Na medicina veterinária dificuldades na cicatrização de feridas são encontradas com freqüência, especialmente na clínica de eqüinos, e os resultados dessa avaliação inicial da capacidade do PRP em estimular angiogênese pode justificar futuros testes para avaliar sua contribuição nesses casos e a possibilidade de incorporar seu uso à rotina. Por outro lado, caso os resultados indiquem que a eficiência do PRP para esse fim é menor do que a esperada, pode-se evitar experimentos mais elaborados com o produto.

A utilização da CAM como modelo em pesquisas em angiogênese está consolidada. No entanto faz-se necessário estabelecer um protocolo em especial no tocante à avaliação quantitativa, uniformizando os métodos e o software utilizado, quando necessário. Tal medida possibilitaria a comparação de dados de vários laboratórios, otimizando o uso dos resultados dos experimentos em termos de comparação. Através das avaliações descritas, pretendemos quantificar a diferença de resultados entre as metodologias de avaliação, e determinar aquela com maior acurácia para a quantificação da angiogênese nesse modelo de pesquisa.

Durante o estudo piloto estaremos nos concentrando na superação das dificuldades esperadas, considerando as fases de ativação do PRP e avaliação quantitativa dos fragmentos de CAM.

Será necessário estabelecer uma proporção ótima de entre PRP e solução ativadora (trombina + CaCl), visto que a literatura traz referências diferentes para essa relação. Grande atenção será direcionada à coloração das lâminas de CAM, uma vez que várias possibilidades são descritas na literatura. Esses aspectos serão cuidadosamente discutidos e definidos no decorrer do estudo piloto, etapa fundamental na execução deste projeto.

O trabalho receberá financiamento parcial do PROAPE - UFG