IMUNOISTOQUÍMICA DE RECEPTORES DE SUPERFÍCIE EM
MACRÓFAGOS ESPUMOSOS: estudo comparativo entre placas de aterosclerose em
humanos e fígado de bovinos
(Projeto de Pesquisa)
TRINDADE,
B. R.; ARAÚJO, E. G.; FLEURY, L. F. F.; MENEZES, L. B.; LINO JÚNIOR, R. S.;
FIORAVANTI, M. C. S.
Escola
de Veterinária da UFG
Orientadora:
clorinda@vet.ufg.br
Palavras-chave: aterosclerose, fígado de bovinos, macrófagos espumosos.
Ao considerar-se a taxa de abate do ano de 2003 de 36% nos Estados Unidos, 42% no México e 62% na Itália, evidencia-se o potencial de desenvolvimento da pecuária de corte no Brasil que apresenta uma taxa avaliada em 24% (ANUALPEC, 2003). Isso mostra também a necessidade urgente de aumento da eficiência deste setor, para que o Brasil possa competir no mercado globalizado. LUCHIARI FILHO (2000) confirma a importância dos setores da produção animal e da indústria da carne para a economia brasileira, porém CARNEIRO (2001) cita que a baixa produtividade do rebanho brasileiro torna a maioria dos criatórios inviáveis e despreparados para competir com rebanhos e segmentos mais eficientes e organizados. Portanto pesquisas que procurem identificar os mecanismos envolvidos na baixa eficiência produtiva dos rebanhos são de extrema importância para o país.
FIORAVANTI (1999) trabalhando com bovinos aparentemente normais encontrou correlação negativa entre peso vivo das fêmeas e dos machos e o número de macrófagos espumosos encontrados no fígado. A correlação negativa também foi significativa entre a intensidade da doença e o peso vivo das fêmeas, conseqüentemente apesar de as lesões histopatológicas não provocarem sinais clínicos e não determinarem alterações macroscopicamente observáveis, o funcionamento do órgão foi afetado, refletindo-se negativamente no ganho de peso.
A reação granulomatosa no fígado
de bovinos apresenta grande semelhança com a presente em placas de
aterosclerose em humanos. Como a etiopatogenia da aterosclerose está bem
caracterizada, espera-se que um estudo comparativo utilizando diferentes
marcadores para macrófagos espumosos possa elucidar pontos importantes ainda
obscuros na etiopatogenia do processo que determina o surgimento dessas células
em fígado de bovinos aparentemente saudáveis.
2 METODOLOGIA
Serão
utilizados 20 fragmentos de aorta de humanos, colhidos pelo serviço de
Patologia da Faculdade de Medicina/UFG, nos quais pela coloração de triagem de
HE tenha sido identificadas placas de aterosclerose e 20 fragmentos de fígado
de bovinos aparentemente saudáveis que foram mantidos em pastagem de Brachiaria sp. por um período mínimo de
seis meses que na coloração de HE apresentaram aglomerados de macrófagos
espumosos. Os cortes serão submetidos à coloração de Mallory para fibras
colágenas (LUNA, 1968); calleja com permaganato para evidenciação das fibras
elásticas (SCHEVER & LEFKOWITCH, 1994); retículo-reticulina para evidenciar
as fibras reticulares (SCHEVER & LEFKOWITCH, 1994). Será também realizada a
imunoistoquímica de todos os fragmentos.
A técnica de imunoistoquímica,
utilizará anticorpos primários dirigidos contra o receptor CD14, CD36, CD68,
VCAM - 1, ICAM - 1 e vimentina, este último utilizado como controle positivo,
evidenciando a presença de fibras colágenas. A técnica será realizada segundo
protocolo do Laboratório de Imunoistoquímica da Faculdade de Medicina
Veterinária da Unesp/Botucatu (LAUFER AMORIM, 2002).
A) Bloqueio
da peroxidase endógena (50% de metanol + 50% de peróxido de hidrogênio a 3% -
10 minutos);
B) Incubação
com BSA a 1% (câmara úmida – 10 minutos – temperatura ambiente);
C) Incubação
com anticorpo primário (câmara úmida – over
night – 4oC);
D) Incubação
com anticorpo secundário biotinilado (câmara úmida – 1 hora – temperatutra
ambiente);
E) Incubação
com complexo ABC (câmara úmida – 1 hora – temperatura ambiente);
F) Cromógeno
(DAB – até o momento da visualização da reação);
G) Lavagem
em água corrente – 10 minutos;
H) Contracoloração
com methyl green a 2% (10 minutos -
58oC).
Os cortes serão analisados em microscópio de campo claro. O procedimento
será realizado no Setor de Patologia da Escola de Veterinária da UFG. Será
feita a classificação dos aglomerados de macrófagos espumosos em positivos e
negativos para cada um dos receptores utilizados. A quantificação da expressão
de receptores CD14, CD36 e CD68 nos aglomerados de macrófagos espumosos
presentes nos fragmentos de placas de aterosclerose e fígado de bovinos será
realizada estabelecendo-se escores. Sendo que em caso de ausência de marcação
de receptores em todo fragmento o escore será zero, se até 25% dos aglomerados
apresentarem marcação positiva o escore será um, de 25% a 50% dois, de 50 a 75%
três e acima de 75% atribuir-se-á escore quatro ao fragmento. As freqüências
obtidas em placas de aterosclerose em humanos e fígado para cada um dos
receptores que serão pesquisados, CD14, CD36, CD68, ICAM - 1 e VCAM – 1, serão
comparadas pelo teste de c2 com correção para a
continuidade ou pelo teste exato de Fischer, dependendo das freqüências
obtidas, ao NS de 5% (CURI, 1997). Os escores obtidos com a quantificação da
expressão dos receptores CD14, CD36 e CD68, em placas de aterosclerose em
humanos e fígado de bovinos, serão comparados pelo teste não paramétrico de
Mann & Whitney utilizando-se o programa estatístico SAEG (UFV, 2003).
Espera-se determinar a patogenia da enfermidade, pois
se observada a expressão dos mesmos receptores de superfície, destacadamente o
CD36, nos macrófagos espumosos do fígado de bovinos assim como nas placas de
aterosclerose em humanos inferir-se-á que estas células estão realizando a
mesma função em ambos os processos, ou seja, a fagocitose de colesterol ou
triglicerídeo modificado por oxidação. A obtenção deste possível resultado
poderá contribuir para a determinação definitiva da etiologia da enfermidade,
ajudando a esclarecer se a enfermidade está ligada a esporidesmina ou
diretamente a braquiária. Com a determinação da patogenia da enfermidade será
possível obter subsídios para o estabelecimento de medidas profiláticas, como a
utilização de anti-oxidantes, objetivando evitar perdas e conseqüentemente
melhorar o desempenho dos animais para que a pecuária de nosso país, muito
dependente do regime de criação a pasto, tenha mais condições de competir no
atual mercado global.
1.
ANUALPEC. Anuário da
Pecuária Brasileira. São Paulo: FNP Consultoria & Comércio, 2003. Ed. Argos,
400p.
2. CARNEIRO, R.B. Avaliação
do desempenho e das características de carcaça de novilhos nelore,
suplementados a pasto, na estação chuvosa. Goiânia. 2001. 122p. Dissertação
(Mestrado). Universidade Federal de Goiás.
3.
CURI, P. R. Metodologia e análise da pesquisa em ciências
biológicas.
Botucatu: Tipomic, 1997. 256 p.
4.
FIORAVANTI, M. C. S. Incidência, avaliações clínica,
laboratorial e anatomopatológica da intoxicação subclínica por esporidesmina em
bovinos. Botucatu, 1999. 256p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) -
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista
5.
LUNA, L. G. Manual
of histologic staining methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3ed. New York: McGraw-Hill, 1968. 258p
6. LAUFER AMORIM, R. Roteiro
para a realização da técnica de imunosistoquímica. Botucatu: Laboratório de
imunoistoquímica da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade Estadual Paulista, 2002. 5 p. [Apostila].
7.
SCHEVER, P. J.; LEFKOWITCH, J. H. Liver biopsy interpretation. 5ed. Philadelphia: Sauders Company, 1994. 315p.
8. UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA/SAEG. Sistema de análises estatísticas e
genéticas. Versão 8.1, Viçosa: 2003. 301 p. (Manual do usuário).