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Título: Óxido nítrico amplifica a produção de interferon gama (IFNγ) induzido pelo superantígeno MAM

PIRES, A. s.; rEzENDE, g.t.; Shio, M. T.; Ribeiro-Dias, F. (orientação)

Laboratório de Imunidade Natural/Setor de Imunologia/IPTSP/UFG

Departamento de Microbiologia, Imunologia, Parasitologia e Patologia

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública

Universidade Federal de Goiás

E-mail: alausepires@hotmail.com

O Mycoplasma arthritidis é uma bactéria que induz formas agudas e crônicas de artrite em roedores cujas características histopatológicas são similares às da Artrite Reumatóide humana, uma doença autoimune de etiologia desconhecida. Esta bactéria secreta um potente superantígeno, o MAM (do inglês “Mycoplasma arthritidis mitogen”), que induz a produção de IFNg e NO, ambos importantes nos mecanismos lesivos na artrite em roedores. O objetivo do presente trabalho é avaliar as interações entre NO e IFNg em culturas de células esplênicas murinas ativadas por esse superantígeno. Para tal foram utilizadas células esplênicas obtidas por rompimento mecânico do baço e cutivadas na ausência ou na presença de MAM ou ConA e tratadas com aminoguanida ou anticorpos neutralizantes de IFNg em diferentes concentrações. As concentrações de NO e IFNg dos sobrenadantes foram determinadas por reação de Griess e ELISA, respectivamente. O MAM induziu a produção de NO e IFNg nas culturas e quando tratadas com anticorpos neutralizantes de IFNg foi observado a inibição da produção de NO. Os dados sugerem que o IFNg é necessário para a produção de NO e que o NO regula positivamente a produção de IFNg induzida pelo superantígeno.

Palavras-chave: Superantígeno, MAM, NO e IFN-g

INTRODUÇÃO: O Mycoplasma arthritidis é uma bactéria que induz formas agudas e crônicas de artrite em camundongos, ratos e coelhos cujas características histopatológicas são similares às da Artrite Reumatóide humana, uma doença autoimune de etiologia desconhecida (Cole, 1999). Esta bactéria secreta um potente superantígeno, o MAM (do inglês “Mycoplasma arthritidis mitogen”), que induz algumas citocinas, entre as quais duas destacam-se pelas suas funções imunorregulatórias, a interleucina-12 (IL-12) e o interferon gama (IFNg) (COLE & THORPE, 1984; MU et al., 2000). O IFNg é uma citocina que potencializa importantes funções das células apresentadoras de antígeno e induz a produção de óxido nítrico (NO, do inglês “nitric oxide”).Além de induzir as citocinas acima, o MAM induz ainda a produção de NO em culturas de células peritoneais (RIBEIRO-DIAS et al., 2003). Além da sua função citotóxica, o NO tem importante função em reações inflamatórias, sendo uma molécula efetora na atrite (AMIN et al., 1999). OBJETIVO: O objetivo do presente trabalho é avaliar as interações entre NO, IFNg e IL-12 em culturas de células esplênicas murinas ativadas com o superantígeno MAM. METODOLOGIA: Foram cultivadas células esplênicas murinos em diferentes concentrações celulares na ausência ou presença do MAM. Para avaliar a relação entre o NO e IFNg as co-culturas foram tratadas com várias concentrações de Aminoguanidina ou anticorpo neutralizante de IFN-g. Após diferentes períodos de incubação, foram colhidos os sobrenadantes das culturas para dosagem de nitritos e IFN-g em diferentes períodos de incubação, utilizando a reação de Griess (NO) e o ELISA (IFNg). Os dados são representados como média ± EPM e foram analisados por ANOVA/Bonferroni, sendo estabelecida significância quando p<0,05. RESULTADOS/DISCUSSÃO: O MAM induziu a produção de NO em concentrações significantes após 48 h de incubação (7,0 + 0,8 vs 14,4 + 1,1 mM NO₂^-, n = 5, p < 0,001) e a produção de IFNg, que foi detectável após 6 h de incubação, atingiu o pico de produção em 24 h de cultura (94,4 + 17,6, n = 5, p<0,05). Pouca alteração na produção de IFNg foi detectada entre 24 e 48 h de incubação e o mitógeno ConA usado como controle, induziu altos níveis de IFNg após 24 ou 48 h de incubação (201,8 + 12,0 e 167,7 + 8,3 ng/mL respectivamente, n = 5). A rápida produção de IFNg detectada em nossas culturas sugeriu que esta citocina poderia ser necessária para a indução de NO pelo MAM. Para avaliar esta hipótese, as culturas foram tratadas com anticorpo neutralizante de IFNg e foi observado que o IFNg é necessário para a produção de NO induzida pelo MAM. Na dose de 25 mg/mL de anticorpo a produção de NO foi completamente inibida (14,7 + 1,4 vs 3,9 + 0,5 mM NO₂^-, n = 5, p < 0,001). Os resultados mostram que o MAM induziu uma rápida produção de IFNg, o qual é necessário para a ótima indução de NO. Sabendo que o NO em baixas concentrações pode apresentar efeitos estimulatóros sobre células do sistema imune (BOGDAN et al., 2000; NIEDBALA et al., 2002) analisamos se as baixas quantidades de NO induzidas pelo MAM em nossas culturas interferem com a produção de IFNg. Para isto, a produção de NO foi inibida pela aminoguanidina, um inibidor seletivo da NO sintase (HASSAN et al., 1993), em diferentes concentrações (10^-3, 10^-5 ou 10^-7 M). A dose efetiva de aminoguanidina para inibir completamente a produção de NO foi 10^-3 M (14,7 + 1,4 vs 2,7 + 1,0 mM NO₂^-, n = 5, p < 0,01). Esta dose de aminoguanidina também inibiu significantemente a produção de IFNg induzida pelo MAM após 24 h de incubação (94,4 + 17,6 vs 48,0 + 2,6 ng/mL, n = 5, p < 0,01), sendo mantida a inibição após 48 h (90,2 + 20,6 vs 44,0 + 2,9 ng/mL, n = 5, p < 0,01). Estes dados sugerem que o NO sinaliza positivamente para a indução de IFNg pelo MAM, principalmente no intervalo entre 12 e 24 h de cultura. CONCLUSÕES: Nós mostramos que o MAM induz sequencialmente IFNg e NO em culturas de células esplênicas de camundongos BALB/c, sendo esta a primeira vez que são descritos os cursos temporais das produções de NO e IFNg induzidos pelo MAM em culturas de células esplênicas. Os dados mostram que o IFNg é necessário para a produção de NO induzida pelo MAM e sugerem que o NO regula positivamente a produção de IFNg induzida pelo superantígeno

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Fonte de Financiamento: CNPQ e FUNAPE