Número de cadastro do projeto: 22000000228

Atividade Fungitóxica de Extratos de Ocimum gratissimum.

Produtos Naturais Isolados e Derivados Sintéticos sobre Paracoccidioides brasiliensis

SALES, W. S.; LEMOS, J. A.; PAULA, J. R.;SILVA, M. R. R.

Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública – UFG

Resumo

O aumento na incidência de infecções fúngicas tem sido motivo de preocupação. Doenças, como a paracoccidioidomicose, são geralmente silenciosas e de diagnóstico tardio, dificultando seu tratamento e prognóstico . Pelos diversos efeitos colaterais dos antifúngicos atuais, a resistência dos fungos aos mesmos e seu alto custo, terapias alternativas, como plantas medicinais, vêm sendo utilizadas pela população. Tem-se estudado os princípios antimicrobianos e antifúngicos destas plantas. Ocimum gratissimum (alfavaca-cravo) foi objeto deste estudo, por apresentar propriedades antimicrobianas. Verificou-se, por teste de suscetibilidade de diluição em ágar, a inibição do crescimento de células leveduriformes e da transição da fase filamentosa para leveduriforme no P. brasiliensis pelo óleo essencial desta planta e seu principal constituinte, o eugenol. Verificou-se o comportamento de dois isolados de P. brasiliensis através de curva de crescimento adicionando-se ao meio de cultura concentrações de 500 e 250µg/mL de eugenol e/ou óleo essencial. A diferença da curva de crescimento de P. brasiliensis sobre o controle mostrou-se significativa (teste t ,p < 0,05) no 11° e 13° dias para P. brasiliensis 1578 sob eugenol em concentração de 500µg/mL. Verificou-se que compostos de O. gratissimum, como o eugenol, apresentam atividade inibitória in vitro para P. brasiliensis.

Palavras-chave: Paracoccidioidomicose; Ocimum gratissimum.

Introdução

Altos investimentos para a obtenção de medicamentos sintéticos têm levado a uma procura cada vez maior de recursos naturais, despertando o interesse para a pesquisa do potencial medicamentoso das plantas. Só nos EUA, 25% do receituário médico, entre as décadas de 60-80, continham extratos de plantas ou algum princípio deles extraído (MITSCHER et al, 1987).

O Ocimum gratissimum, conhecido como alfavaca, é uma das plantas mais utilizadas popularmente. A alfavaca, segundo FARIAS et al, 1994, possui ação contra alguns fungos como Aspergillus sp, dermatófitos e Trichoderma sp e bactérias como Staphylococcus sp. Há indicações de que a atividade de O. gratissimum deve-se principalmente ao Eugenol, principal constituinte desta planta. Vários experimentos têm mostrado que a atividade biológica é maior quando a planta é coletada ao meio dia, pois o Eugenol apresenta-se em maior concentração neste horário (SILVA et al, 1999).

O Paracoccidioides brasiliensis causa a paracoccidioidomicose, uma infecção com elevado número de casos registrados nas regiões Sudeste e Centro-Oeste do Brasil (LACAZ, 1994, Restrepo 2000, Coutinho et al. 2002), e a micose sistêmica mais comum em indivíduos imunocompetentes.

Paracoccidioides brasiliensis é encontrado, na natureza sob a forma miceliana (> 25ºC) e no hospedeiro como levedura (35-37ºC) (Franco et al. 2000). O processo de dimorfismo também ocorre in vivo. Quando a doença se manifesta no hospedeiro, ocorre a maioria das vezes pela inalação do fungo na fase miceliana o qual se transforma gradualmente na forma leveduriforme.

Diante do exposto, constata-se que a paracoccidioidomicose assume um papel relevante no contexto de nossa saúde pública, levando-se em conta, entre outros, os fatores geográficos. Assim, o uso de plantas medicinais pode representar um recurso terapêutico alternativo barato para o tratamento de doenças fúngicas de importância em nossa região.

Nosso objetivo foi avaliar a atividade do óleo essencial e do eugenol de O. gratissimum no crescimento de células leveduriformes e na transição do micélio para levedura em P. brasiliensis.

Materiais e métodos

A planta, O. gratissimum L., foi cultivada no Horto de Plantas Medicinais da Faculdade de Farmácia/UFG, coletada volta das 11h da manhã e dessecadas à temperatura ambiente. Por hidrodestilação, o óleo essencial foi extraído das folhas frescas de O. gratissimum e acondicionados a – 10°C até utilização. O eugenol, substância química, componente do óleo essencial foi obtida comercialmente do laboratório Sigma Co. USA.

Foram utilizados nos testes de suscetibilidade, isolados de Paracoccidioides brasiliensis ( 01 e 1578), obtidos de pacientes que procuraram nosso laboratório. Foi preparado meio de caldo RPMI 1640, tamponado com ácido morfolínopropanosulfônico (MOPS) a pH 7,0 o qual foi distribuído em 11 tubos de ensaio, de tal modo que o 1º contivesse 9 ml deste meio e os demais 5 ml. Ao tubo numero 1 foi adicionado 100mg de cada um dos extratos de O. gratissimum (extrato bruto etanólico, fração hexânica, clorofórmica, acetato de etila, óleo essencial e o eugenol), diluídos em 1ml de dimetilsulfóxido (DMSO).

Após homogeneização, foi transferido 5ml do 1^o tubo para o 2º, e assim sucessivamente (diluição ao dobro) de tal modo que as concentrações variaram de 10000 a 9,8 mg/ml, Em seguida de cada tubo foi transferido 2ml da solução para uma placa de Petri na qual se acrescentou 18ml de ágar RPMI 1640, fazendo-se uma perfeita homogeneização, de tal modo que as concentrações do extrato ficaram diluídas 10 vezes obtendo-se, concentrações que variaram de 1000 a 0,9 µg/ml.

A avaliação de bioatividade de O. gratisssimum sobre Paracoccidioides brasiliensis foi feita pela medida dos halos de crescimento (diâmetro da colônia, em mm), por períodos de 15 dias, e comparados a uma placa controle, onde não havia extrato da planta.

Resultados e Discussão

Foi observado que o eugenol e o óleo essencial de O. gratissimum possuem atividade de inibição no desenvolvimento das colônias de P. brasiliensis nas concentrações utilizadas de 500 e 250 µg/mL. Isso foi verificado através de curva de crescimento obtida em diferentes dias. A inibição de Pb 1578 e 01 pelo óleo essencial de O. gratissimum e por eugenol foi significativamente diferente (p< 0.05) nas concentrações de 500µg/mLe 250µg/m, em relação ao controle (sem adição de qualquer componente da planta [p< 0.05]).

A transição da forma filamentosa para leveduriforme dos dois isolados de P. brasiliensis sob a ação do eugenol nas concentrações de 500 e 250 mg/mL foi significantemente menor do que quando comparada ao controle (sem adição da planta).

A ação do óleo essencial de O. gratissimum nas concentrações de 500 mg/mL e 250mg/mL não foi capaz de inibir significativamente (p < 0,05) a transição da fase filamentosa para leveduriforme do P. brasiliensis 1578. A transição da forma filamentosa para leveduriforme do isolado de P. brasiliensis 01 sob a ação do óleo essencial nas concentrações de 500 e 250 mg/mL foi significantemente menor do que quando comparada ao controle.

A obtenção de maior crescimento de P. brasiliensis do controle quando comparado ao crescimento deste fungo adicionado de eugenol ou de óleo essencial verficada pelas curvas de crescimento mostra a elevada atividade fungitóxica destes componentes sobre este fungo. O comportamento de crescimento de P. brasiliensis (01) sob a atividade do eugenol que foi menor a 250µg/mL do que a 500µg/mL parece a princípio sem explicação. No entanto a análise da curva de regressão mostrou que na concentração de 500µg/mL de eugenol sobre Pb 01 houve uma diferença significativa no 2º dia de contato (ponto de intersepto) do fungo com este composto, o que pode ter levado a morte um grande número de suas células, interferindo nos resultados posteriores (inclinação).

Conclusões

A transição é considerada de elevada importância no desencadeamento da doença. Propágulos do fungo na fase filamentosa penetram por via inalatória sendo que a transformação para a fase leveduriforme ocorre durante o estabelecimento inicial da infecção após o fungo ganhar acesso ao hospedeiro através de sua porta de entrada, os pulmões. Portanto, a inibição de transformação do fungo (Pb 01 e 1578) da fase miceliana para leveduriforme obtida pelo óleo essencial e eugenol visualisada pelas curvas de crescimento podem representar a base para futuros experimentos, na tentativa de busca de novos fármacos.

Referências Bibliográficas

FARIAS MR, SIMÕES CMO, RECH N, BOFF PR, STORB BH, ROVARIS DA 1994. Espécies vegetais empregadas na produção de fitoterápicos em Santa Catarina .In: Simpósio de plantas medicinais do Brasil. Fortaleza Anais, 125p.

FRANCO M, BAGAGLI E, SCAPOLIO S, LACAZ CS 2000. A critical analysis of isolation of Paracoccidioides brasiliensis from soil. Med Mycol 38: 185-191.

LACAZ CS, DEL-NEGRO G 1994. Drogas antifúngicas; terapêutica das micoses In: Silva P Farmacologia. Ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro p.1156-1190.

MITSCHER, LA., DRAKE, S., GOLLAPUDI, SR. E OKWUTE SK. (1987) ‘A Modern Look at Folkloric use of Anti-Infective Agents’, J. Nat. Prod. 50, 1025.

SILVA MGV, CRAVEIRO AA, MATOS FJA, MACHADO MIL, ALENCAR JW. Chemical variation during daytime of constituents of the essential oil of Ocimum gratissimum leaves. Rev. Fitoterapia 70 :32-34, 1999.

Fonte de Financiamento: CNPq