UNIVERSIDADE
FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE
VETERINÁRIA
DEPARTAMENTO
DE MEDICINA VETERINÁRIA
RELATÓRIO FINAL DE BOLSISTA PIBIC
TÍTULO DO PROJETO
Desenvolvimento
e avaliação de técnicas em biologia molecular aplicadas ao diagnóstico de
enfermidades de animais de interesse econômico na região Centro-Oeste (Processo
Nº 520779/99-1).
TÍTULO DO SUBPROJETO:
Ensaios de PCR para a
detecção espécie-específica de Brucella
abortus.
Coordenador: Prof. Dr. Guido Fontgalland C. Linhares.
Email: saviacalline@bol.com.br
2004
Resumo
A brucelose é uma enfermidade
infecto-contagiosa, transmissível de animal para animal e desses para o homem.
A enfermidade resulta em custos diretos ou indiretos para as propriedades
rurais e para a indústria animal, tais como: condenação de leite e carne;
redução no preço da carne, do leite e derivados; desvalorização para o mercado
externo; altos custos com programas de controle, erradicação e pesquisas, além
de perdas de animais por infertilidade e por descartes. Entre os métodos de
diagnóstico direto, uma das grandes vantagens da técnica de reação em cadeia da
polimerase (PCR) sobre os métodos convencionais, está na rapidez e na
simplicidade do método. A técnica é ainda extremamente sensível, podendo
detectar uma simples molécula de DNA em uma amostra. Desta forma, este trabalho
teve como objetivo avaliar ensaios de PCR para o diagnóstico de Brucella
abortus e comparar a sensibilidade e especificidade de diferentes
protocolos e primers.
INTRODUÇÃO
Ocorrendo endemicamente em todo o território
nacional, a brucelose bovina pode ser diagnosticada em qualquer rebanho,
independentemente do sistema de criação e exploração econômica. Além dos
prejuízos que a brucelose provoca na própria economia pecuária, seja na queda
na produção de leite, seja através da perda de carnes, comprometendo seriamente
a produção do rebanho nacional, deve-se ressaltar a queda da produtividade, traduzida
pelo aumento significativo do número de vacas estéreis e conseqüente declínio
da taxa de natalidade (Boletim de Defesa Sanitária Animal, 1998).
Para os programas de controle e erradicação da brucelose, a
sorologia para brucelose é o método mais utilizado para o diagnóstico, que é
feito a partir de amostras de soro ou plasma sangüíneos (Gonzáles Tomé, 1993;
Vanzini, 1995; Bercovich, 1998). O problema verificado com o método sorológico
é o grande número de reações cruzadas com outros microganismos Gram-negativos,
especialmente com várias espécies dos gêneros Yersinia e Salmonella,
assim como Escherichia coli (Gallien et al., 1998).
Em face ao exposto,
justifica-se plenamente o emprego e desenvolvimento de estudos que visem a
viabilização do uso de métodos alternativos avançados, não convencionais, no
diagnóstico e no estudo epidemiológico das enfermidades que acometem os animais
de interesse econômico da região.
Gallien
et al. (1998) demonstraram ser o PCR uma técnica mais sensível do que os
métodos convencionais de bacteriologia utilizados no diagnóstico de Brucella spp. Sendo assim, optou-se pelo
uso da técnica para tornar o diagnóstico direto mais sensível e seguro.
1. OBJETIVOS
Os principais objetivos do trabalho foram
avaliar:
·
ensaios de reação em
cadeia da polimerase (PCR) para o diagnóstico de Brucella abortus, a partir de informações publicadas;
·
novas
seqüências de oligonucleotídeos para a execução da técnica de PCR para Brucella abortus;
·
a
sensibilidade da reação de PCR, empregando-se diferentes combinações de
primers, protocolos e programas para o termociclador.
2. MATERIAL
E MÉTODOS
2.1. AVALIAÇÃO DE ENSAIOS DE PCR A PARTIR DE PROTOCOLOS E
PRIMERS PUBLICADOS NA LITERATURA CIENTÍFICA.
Na avaliação da técnica do PCR para o diagnóstico de Brucella
abortus, foram testados dois diferentes protocolos e seqüências de pares de
nucleotídeos sintéticos (primers), a partir de informações publicadas na
literatura científica (Romero et al.,
1995; Sreevatsan et al., 2000).
O par de primers F4/R2, de Romero et al.
(1995), foram construídos, originalmente, para amplificar um fragmento de 905
pares de base (pb) do gene 16S rRNA de Brucella spp., enquanto que o par
Bruce1/Bruce2, de Sreevatsan et al. (2000) foram desenhados para se
obter um amplicon 311pb do gene de uma proteína de 31 kDa de Brucella
abortus (Quadro 1).
Quadro 1.
Seqüências e especificidade dos primers, conforme relatado pelos
respectivos autores.
PRIMERS
|
ORIGEM |
SEQÜÊNCIAS |
ESPECIFICIDADE |
|
F4 (forward) |
Romero et al.,
1995 |
5´-tcg agc gcc gcg aag
ggg-3´ |
Brucella spp. |
|
R2 (reverse) |
Romero et al.,
1995 |
5´-aac cat agt gtc tcc act
aa-3´ |
Brucella spp. |
|
Bruce1 (forward) |
Sreevatsan et al.,
2000 |
5´-acg cag tca gac gtt gcc
tat-3´ |
Brucella abortus |
|
Burce2 (reverse) |
Sreevatsan et al.,
2000 |
5´-tcc agc gca cca tct
ttc agc ctc-3´ |
Brucella abortus |
As concentrações dos reagentes para o
preparo do mix de reação de PCR, assim como o emprego dos pares de primers
e programação dos ciclos de temperatura (desnaturação, anelamento e extensão)
foram feitas em consonância com as informações descritas pelos respectivos
autores.
2.2. AVALIAÇÃO DE ENSAIOS DE PCR A PARTIR DE PROTOCOLO E
PRIMERS NOVOS.
Com o objetivo de buscar um melhor equilíbrio entre a
temperatura de anelamento do primer Bruce1 com a do primer Bruce2,
foram efetuadas modificações na extremidade 5´ e 3´ destes, ou seja, do primer
Bruce1 foi excluída a base nitrogenada “T” da extremidade 3´ e, do primer
Bruce2, foram excluídas as bases “T” da extremidade 5´ e “CCTC” da
extremidade 3´. Com esta modificação nas seqüências a temperatura de anelamento
foi ajustada para 56 oC, de acordo com a metodologia descrita por
Mullis et al. (1994) (Quadro 2).
Quadro 2.
Seqüências dos primers Bruce1 e Bruce2 modificados.
PRIMERS
|
SEQÜÊNCIAS |
TEMP. ANELAMENTO |
|
Bruce1 modificado (forward) |
5´-acg cag tca gac gtt gcc ta -3´ |
57 oC |
|
Bruce2 modificado (forward) |
5´-cca gcg cac cat ctt
tca-3´ |
55 oC |
O protocolo utilizado nesta fase para a execução
da técnica do PCR foi estabelecidos através de adaptações dos procedimentos descritos
por Innis et al. (1990). Portanto
definiu-se os seguintes componentes e respectivas concentrações para a mistura
da reação: 41,75ml de água
ultrapura esterilizada; 5ml de
tampão para PCR (PCR buffer 10x – 100mM Tris-HCl, pH 9, 15mM MgCl2 e
500mM KCl - Amersham Pharmacia Biotech); 1ml de dNTP 10mM (Amersham Pharmacia Biotech); 0,5ml (=10 pM)
de cada primer; 0,25ml de Taq DNA Polimerase (5U/ml -
Amersham Pharmacia Biotech); e 1ml (»0,35mg) da
amostra do DNA genômico.
As extrações do DNA das amostras foram executadas de acordo
com metodologia descrita por Kawasaki (1990).
Como controles para as reações de PCR e para a avaliação da
especificidade dos primers foram
utilizadas amostras de DNA genômico, extraídas de culturas puras e tipificadas
(amostras de referência - ATCC), mantidas em meios de culturas específicos das
seguintes espécies: Brucella abortus, B.
suis, B ovis e B canis.
O controle negativo se constituiu de água ultrapura
inoculada na mistura de reagentes (mix)
da reação, nas mesmas concentrações utilizadas para as amostras inoculadas com
DNA.
Os produtos obtidos pela amplificação de DNA,
foram submetidos a eletroforese em gel de agarose a 1%, contendo 2% de brometo
de etídio (0,4mg/ml) e, em seguida observados em transiluminador com luz ultravioleta
em sala escura (Costa et al. 1996).
Para a determinação do tamanho dos fragmentos amplificados, foi utilizado 1mg
de marcador de peso molecular de 100pb. As amostras que foram testadas, assim
como o marcador de peso molecular e os controles positivo e negativo foram
previamente homogeinizados com solução corante (25% Ficoll 400,0,25% azul de
bromofenol, 0,25% xileno cianol em 9 partes de glicerol) para melhor avaliação
do tempo de corrida da eletroforese.
Os resultados de interesse, obtidos pela eletroforese,
serão documentados através da fotografia com câmara polaroid. O material
fotográfico será utilizado para publicações científicas e apresentação em
reuniões científicas.
2.3.
COMPARAÇÃO DA SENSIBILIDADE ENTRE OS ENSAIOS DE PCR
Com a finalidade de verificar, entre os
diferentes protocolos estudados, qual apresentava maior sensibilidade para a
detecção de fragmentos DNA de B. abortus, a amostra de DNA genômico,
utilizada como referência para esta espécie, foi diluída em série de 1/10 a
1/10.000.000. As diluições foram todas submetidas à duas reações de PCR. A
primeira empregando-se primers e protocolo descrito por Sreevatsan
et al. (2000) e a outra com os primers modificados e protocolo
adaptado, conforme descrito no item 2.2.
3.
RESULTADOS
E DISCUSSÃO
As reações de PCR empregando-se o protocolo e primers
(F4 e R2) de Romero et al. (1995) foram efetivas para a amplificação do
fragmento esperado de 905pb tanto a partir do DNA genômico de B. abortus,
quanto de B. suis, B. canis e B. ovis, sendo portando
caracterizado como um método de diagnóstico gênero-especifíco. Estes resultados
estão de acordo com a informação dos autores, no artigo original.
Os resultados obtidos com o protocolo e primers
(Bruce1 e Bruce2) de Sreevatsan et al. (2000) foram positivos para a
amplificação do fragmento esperado de 311pb de B. abortus, no entanto as
reações também amplificaram fragmentos de tamanho semelhante de B. suis,
B. canis e B. ovis. Estes resultados diferem daqueles publicados
pelos autores do artigo original, no qual apresentaram resultados apontando o
ensaio como sendo espécie-específico para B. abortus.
O ensaio de PCR, realizado com os primers de
Sreevatsan et al. (2000) modificados neste trabalho e designados de
Bruce1 mod. e Bruce2 mod., apresentaram resultados semelhantes no aspecto de
especificidade, amplificando fragmentos de DNA de B. abortus, B. suis, B. canis e B. ovis.
Portanto o método deve ser reconhecido como gênero-específico. Como
desvantagem, com relação ao método original, foi observado amplificação de
algumas bandas inespecíficas.
Modificações efetuadas nas seqüências dos primers Bruce1 e Bruce 2, selecionados
originalmente por Sreevatsan et al.
(2000), assim como nas condições de temperaturas empregadas nos ciclos e
concentrações, proporcionaram um aumento na sensibilidade de detecção do DNA
genômico de Brucella, na ordem de 10
vezes. A reação de PCR no primeiro caso foi positiva até a diluição de
1/100.000 enquanto que naquela empregando-se primers modificados e novo
protocolo, o resultado foi positivo até a diluição de 1/1.000.000. A maior
sensibilidade observada na segunda reação de PCR na qual foram utilizados os primers
modificados, pode ser explicada pelo maior equilíbrio na e temperatura de
anelamento entre os pares de primers, conforme Mullis et al.
(1994).
4.
CONCLUSÕES
As reações de PCR empregando-se os pares de primers F4/r2
e Bruce1/Bruce2 e seus respectivos protocolos originais são efetivas para a
amplificação gênero-específica de Brucella spp. (B. abortus,
B. suis, B. canis e B. ovis).
O novo protocolo proposto neste estudo, empregando-se os
pares de primers Bruce1 modificado e Bruce2 modificado apresentaram
resultados superiores quanto à sensibilidade, no entanto promoveram reações
menos específicas.
5.
REFERÊNCIAS
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