INTRODUÇÃO

A mangabeira (Harconia speciosa) é uma frutífera nativa freqüente no cerrado brasileiro com distribuição ampla neste ecossistema, penetra pela caatinga e chega até os tabuleiros do Nordeste ( LEDERMAN et al., 2000). O sabor distinto do fruto da mangabeira confere a esta frutífera, um grande potencial econômico. Como as demais plantas nativas típicas do ecossistema “Cerrado”, cagaita, piqui, araticum, etc, a mangabeira precisa ser estudada e ter sua variabilidade genética determinada para garantir sua conservação e preservação dentro deste ecossistema.

Para estudos de conservação de populações naturais é necessário um conhecimento detalhado da estrutura genética dessas populações, bem como de seus sistemas reprodutivos (LLERAS, 1992). Nesse sentido, os marcadores moleculares têm sido freqüentemente utilizados em estudos de diversidade e estrutura genética populacional (FERREIRA & GRATTAPAGLIA, 1998).

Os indivíduos do gênero Hancornia apresentam grande quantidade de polisacarídeos e polifenóis possivelmente devido à sua característica lactescente. Estes polissacarídeos presentes em H. speciosa, interferem na reação de polimerase em cadeia (PCR) inibindo a atividade da enzima Taq polimerase (FANG et al., 1992) e conseqüentemente, a amplificação do material genético fica comprometido impossibilitando a sua análise através de marcadores dependentes da PCR.

O presente trabalho objetivou desenvolver um protocolo de extração, purificação e amplificação de DNA com a finalidade de caracterizar geneticamente populações de mangabeira de Goiás, usando o marcador molecular RAPD.

MATERIAL E MÉTODO

Foram feitas viagens de prospecção para identificação de populações a serem analisadas em três áreas situadas no Estado de Goiás, as quais são: Área 1 (Rodovia Mutunópolis – Porangatú, km 16), Área 2 (Rodovia Campinorte – Nova Iguaçú, km 7), Área 3 (Rodovia Caçu – Itarumã, km 3).

As áreas 1 e 2 foram selecionadas de acordo com os seguintes critérios: região ainda não coletada em trabalhos anteriores (norte de Goiás), áreas que sofreram pouca ou nenhuma antropização e que possuem 30 ou mais plantas adultas em um raio de 1 km², resguardando-se uma distância mínima de 20 km entre populações. Já a área 3 representava uma população de plantas cultivadas, uma das poucas, senão a única conhecida no Estado de Goiás. O material para análise foi coletado nas áreas previamente selecionadas. Cada população foi representada por 30 plantas adultas amostradas ao acaso.

A extração do DNA genômico total foi feito segundo o protocolo utilizado por MOURA et al. (2001) a partir de folhas jovens das plantas coletadas, utilizando o método CTAB (Brometo de Cetiltrimetilamônio). Este método consiste em macerar 200 ng de tecido foliar fresco com nitrogênio líquido usando bastão de vidro em microtubos de 1,5 mL e incubação por uma hora a 65⁰C com 700 ml de tampão de extração (100 mM de tris-HCl, pH 8; 20 mM de EDTA; 1,4 M de NaCl; 2% de CTAB; 1% de polivinil e 2% de mercaptoetanol) pré-aquecido. As proteínas foram extraídas com solvente composto por clorofórmio, álcool isoamílico numa proporção de 24:1. Os ácidos nucléicos foram precipitados em isopropanol frio e lavados com etanol a 70%, secos a vácuo e ressuspendidos com tampão Te (10 mM tris-HCl, pH 8; 0,1 mM EDTA), contendo 10 mg/ml de RNA-ase e incubados a 37 ⁰C por 30 minutos.

Inicialmente, foi testado o protocolo de extração usado por MOURA et al. (2001), porém o DNA extraído permaneceu impuro e com coloração parda ou quase preta. Em seguida foi testado um segundo protocolo, que também foi utilizado para a extração de DNA de pequi (Caryocar brasiliense Camb.), sendo possível obter DNA mais limpo, porém o processo de amplificação ainda ficou prejudicado, mesmo estando diluído a uma concentração de 0,5 ng/ml, com rendimento de aproximadamente 8%.

A partir do DNA estoque obtido com o segundo protocolo foi feita uma nova limpeza, promovendo a eliminação de proteínas com fenol/clorofórmio. Finalmente foi possível obter um material com boa qualidade e rendimento para amplificação em PCR permitindo as análises com marcadores moleculares.

De acordo com o segundo protocolo testado foram usados150 mg de tecido foliar fresco com nitrogênio líquido usando chave “Philips” em microtubos de 1,5 mL e incubação por uma hora a 65⁰C com 750 ml de tampão de extração pré-aquecido. As proteínas foram extraídas com clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). À fase aquosa foram adicionados 50ml de uma solução de CTAB a 10% e posteriormente foi repitida a extração com CIA. Os ácidos nucléicos foram precipitados em isopropanol frio e lavados com uma solução 1 M NaCl pois o pellet apresentava-se muito viscoso e escuro. Em seguida, foram feitas 2 lavagens subsequentes com etanol 70% e 1 lavagem com etanol absoluto. Os pellets foram secos e ressuspendidos com tampão TE.

A limpeza de proteínas utilizando fenol/clorofórmio, consiste na adição de 50ml de fenol equilibrado e 50ml de CIA em 100ml de DNA estoque em TE. Após a transferência da fase aquosa para outro tubo foram adicionados 100ml de CIA. A fase superior foi pipetada novamente e foram adicionados 5ml de NaCl 5M para um volume de 100ml e, em seguida, foram colocados 250ml de etanol absoluto gelado. O microtubo foi mantido a - 20°C por no mínimo uma hora. Por fim foram feitas duas lavagens subsequentes com etanol 70% e uma com etanol absoluto. Depois do pellet seco foram adicionados 50ml de TE.

A concentração de DNA nas amostras dos indivíduos foi estimada pela comparação com uma amostra de concentração conhecida de DNA do fago l íntegro, em gel de agarose 0,8%. Foi estimada a concentração de DNA por mL e consequentemente a quantidade total de DNA extraído.

A partir das amostras de DNA, foram feitas as reações de amplificação, de acordo com MOURA et al. (2001). Cada reação consiste de 30 ng de DNA; 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3; 2,0 mM de MgCl; 250 mMde dNTP’s; 250 nM de “primer” e 2 unidades de Taq polimerase. A amplificação enzimática foi feita por um termociclador programado para 48 ciclos, sendo um ciclo inicial de 5 minutos a 94^oC; e 47 ciclos composto de: 92^oC por 30 segundos (desnaturação do DNA), 37^oC por 1 minuto e 30segundos (anelamento do “primer” ao DNA molde) e um ciclo final de polimerização de 72^oC por 6 minutos.

Os fragmentos gerados por amplificação foram separados por eletroforese em géis de agarose horizontais 1,4%, em uma concentração de 1% em tampão TBE (Tris-borato 90 mM e EDTA 2 mM), para verificação de polimorfismo. Após a separação, os resultados foram visualizados por tratamento com brometo de etídeo por 10 minutos, lavagem em água destilada por 5 minutos e posterior visualização em luz ultravioleta com o uso de um transiluminador.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

A partir da extração de DNA utilizando o protocolo de M0URA et al. (2001), foi obtido um material viscoso e pardo, considerado um material impuro. O segundo protocolo (utilizado para extração de DNA de piqui) foi obtido um material mais puro, porém o DNA não amplificava após passar pela PCR. Mesmo diluindo-o a uma concentração de 0,5 ng tinha-se apenas cerca de 8% de rendimento. Por fim, com a eliminação de proteínas utilizando fenol/clorofórmio foi possível obter um protocolo para obtenção de DNA mais específico para ser utilizado em análises com marcadores moleculares para H. speciosa. Com esta técnica foi possível obter uma média de 32,5 ng/ml, a cada 150-200 mg de tecido foliar.

Estabelecido o protocolo de extração, purificação e amplificação do DNA, este está sendo aplicado ás amostras coletadas para se determinar a estrutura genética das populações.

CONCLUSÕES

Apesar de se perder uma certa quantidade de DNA durante a purificação, com o uso de fenol equilibrado e Clorofórmio isoamílico obteve-se considerável melhoria na qualidade do material genético extraído e uma boa amplificação no termociclador.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

FANG G., HAMMAR S. AND REBECCA R.(1992). A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA. BioTechiniques 13:52 56.

FERREIRA, M.E. & GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em análise genética. 2^a Ed., Brasília: Embrapa. 1996. 220 p.

LEDERMAN, I. E.; SILVA JÚNIOR, J.F. da; BEZERRA, J. E. F.; ESPÍNDOLA, A. C. de MELO. Mangaba (Hancornia speciosa Gomez). In: LEDERMAN, I. E. Série Frutas Nativas. Jaboticabal: Funep, 2000. 35p.

LLERAS, E. Conservação de recursos genéticos florestais. Revista do Instituto Florestal Brasileiro. São Paulo, v.4, p. 1179-1184, 1992.

MOURA, N.F. ZUCCHI, M.I.; PINHEIRO, J.B.; VENCOVSKY, R.; CHAVES, L.J.; MOURA, M.F. Seleção de marcadores RAPD para o estudo da estrutura genética de populações de Hancornia speciosa Gomes (Mangaba) In: CONGRESSO NACIONAL DE GENÉTICA. 47. 2001, Águas de Lindóia. Anais... Águas de Lindóia.

FONTE DE FINANCIAMENTO

Este trabalho teve apoio financeiro do CNPq e Capes.